利用酵母雙雜交篩選與IFT20發(fā)生相互作用的蛋白研究.pdf

1、目的:
　　鑒定IFT20蛋白在雄性小鼠中的表達(dá)情況;運(yùn)用酵母雙雜交試驗(yàn)篩選出可能與IFT20蛋白有相互作用的蛋白，為IFT20參與精子發(fā)生的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　分別提取昆明種成年雄性小鼠腦、肺、腎、肝、脾、睪丸及小鼠不同發(fā)育時(shí)期睪丸組織的總蛋白，Western Blot檢測IFT20表達(dá)，睪丸組織切片及生精細(xì)胞分離，免疫熒光染色觀察IFT20蛋白的定位;運(yùn)用PubMed數(shù)據(jù)庫，根據(jù)小鼠Ift加的編

2、碼序列（CDS區(qū)）設(shè)計(jì)特異性引物;RT-PCR擴(kuò)增小鼠睪丸總RNA，Ifi20 cDNA經(jīng)TA克隆后與pGBKT7載體構(gòu)建Ift20/pGBKT7重組質(zhì)粒，酶切和測序鑒定篩選出正確的目的質(zhì)粒;將Ifi20/pGBKT7重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入制備好的AH109感受態(tài)細(xì)胞中，與Clontech公司提供的已提前轉(zhuǎn)入Y187感受態(tài)細(xì)胞中預(yù)轉(zhuǎn)化的小鼠文庫重組質(zhì)粒進(jìn)行酵母雙雜交篩選試驗(yàn)，挑取800個(gè)樣品初步篩選，經(jīng)酵母質(zhì)粒小提后測序，分析重復(fù)檢出次數(shù)在8次以

3、上的蛋白，并挑選關(guān)鍵性蛋白進(jìn)行進(jìn)一步分析。
　　結(jié)果:
　　Western Blot結(jié)果表明IFT20在肺、腎、肝、脾、睪丸組織中均有表達(dá)，但在睪丸組織中的表達(dá)最豐富，且在睪丸中IFT20的表達(dá)隨著精子發(fā)生過程逐漸增加，在精子發(fā)生的第三階段（出生后第30天及之后）表達(dá)豐富，免疫熒光染色顯示IFT20在睪丸組織表達(dá)量豐富，在生精細(xì)胞中，IFT20蛋白在精子發(fā)生的第三階段定位于精子領(lǐng)部位;酶切和測序鑒定Ift20/pGBKT7重

4、組質(zhì)粒構(gòu)建成功。酵母雙雜交篩選試驗(yàn)測序結(jié)果顯示共248個(gè)蛋白被篩選出可能與IFT20相互作用，其中SPATA1出現(xiàn)次數(shù)46次為最多，其次是IFT81、WAC、HAUS1、TEX12、SNAPIN等。選擇性研究IFT20與SNAPIN的相互作用，結(jié)果顯示與IFT20一樣，SNAPIN也在雄性小鼠出生后第30天表達(dá)量開始明顯增加，在精子發(fā)生第三階段也定位于精子領(lǐng)部位;酵母雙雜交轉(zhuǎn)化、體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染和免疫共沉淀試驗(yàn)證實(shí)SNAPIN與IFT20之