利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選銅綠微囊藻生物鐘蛋白KaiA的相互作用蛋白.pdf

1、藍(lán)藻是目前已知具有生物鐘節(jié)律的最簡單生物，它的生物鐘基因簇kai由三個基因組成，分別是kaiA，kaiB，kaiC，它們已被證明是維持藍(lán)藻基本生物鐘節(jié)律所必需的，其中任何一個基因的缺失都會導(dǎo)致生物鐘節(jié)律的消失。在生物鐘節(jié)律產(chǎn)生的過程中，Kai蛋白相互之間以及它們與其他蛋白之間的相互作用可能起著關(guān)鍵作用。其中KaiA的作用是作為一種傳遞來自輸入途徑信息的通道，它通過接受環(huán)境信息后整合入鐘蛋白復(fù)合體中，進(jìn)而激活KaiC自身磷酸化使之發(fā)生構(gòu)象

2、變化。這種Kai蛋白之間和Kai蛋白與其它蛋白的相互作用以及KaiC蛋白的磷酸化狀態(tài)，構(gòu)成了由Kai蛋白振蕩器產(chǎn)生生物鐘守時(shí)機(jī)制的核心。 酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白相互作用的常用方法，為了研究銅綠微囊藻生物鐘基因(Microcystisaeruginosa)kaiA的功能找到與其相互作用的蛋白，我們通過PCR方法克隆得到該基因，然后將其克隆入酵母雙雜交流系統(tǒng)所用的釣餌載體pGBKT7和獵物載體pGADT7中，經(jīng)測序證明正確后，分別

3、將兩組質(zhì)粒pGBKT7-kaiA/pGADT7-kaiA和pGBKT7-kaiA/pGADT7轉(zhuǎn)化入酵母菌AH109中，分析其表達(dá)產(chǎn)物是否會影響酵母菌的生長以及能否激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KaiA蛋白對酵母菌AH109無毒性，也不能激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也證實(shí)了KaiA蛋白在轉(zhuǎn)化酵母菌中可以發(fā)生自身相互作用。實(shí)驗(yàn)還表明我們可以將pGBKT7-kaiA作為酵母GAL4雙雜交系統(tǒng)的釣餌載體，從銅綠微囊藻基因組文庫中釣取與KaiA相互作

4、用的蛋白。因此，我們構(gòu)建了兩種銅綠微囊藻基因組文庫：pGADT7-Sau3AI和pGADT7-HapⅡ，然后通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選基因組文庫中可能與KaiA相互作用的蛋白。實(shí)驗(yàn)最終共篩選得到23個陽性克隆，通過測序和比對，發(fā)現(xiàn)其中有7個未知蛋白與藍(lán)藻有關(guān)，為了確定這些蛋白與KaiA相互作用的結(jié)構(gòu)域，我們分別深入分析了這些蛋白所包含的各種功能結(jié)構(gòu)域與KaiA之間的相互作用。結(jié)果表明，下列功能結(jié)構(gòu)域：DUF29，TRCF，PAP-fibri