七氟烷后處理對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠遠期神經(jīng)學(xué)預(yù)后及機制.pdf

1、目的：本研究旨在構(gòu)建缺氧缺血性腦損傷新生大鼠模型，探討七氟烷后處理對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠是否存在遠期神經(jīng)保護效應(yīng)；在此基礎(chǔ)上，結(jié)合缺氧缺血性腦損傷的病理生理特點等，進一步探討該效應(yīng)是否通過PI3K/Akt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻斷線粒體滲透性轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)。
　　 方法：通過Rice法建立7日齡（P7）新生Sprague-Dawley (SD)大鼠HIBD模型，隨機分為10組（n=12）：假手術(shù)組（Sham）：建模時暴露左頸總動脈后只掛

2、線不結(jié)扎，未予缺氧及七氟烷處理；對照組(HI/Control)：即缺氧缺血模型組，未予七氟烷處理；七氟烷后處理組(HI+Sev)：將HIBD大鼠放入2.5％七氟烷小室中（30％O2+70％N2）30min處理；側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組(HI+Sev+LY)；側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組(HI+Sev+L-N)；側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組(HI+Sev+SB)；側(cè)腦室注射蒼術(shù)苷（atrac

3、tyloside Atr）組(HI+Atr)；側(cè)腦室注射Atr聯(lián)合七氟烷后處理組(HI+Sev+Atr)；側(cè)腦室注射環(huán)孢霉素A（cyclosporin A CsA）組(HI+CsA)；側(cè)腦室注射CsA聯(lián)合七氟烷后處理組(HI+Sev+CsA)；各組均于模型建立（或假手術(shù)）后復(fù)氧前5min側(cè)腦室注射相應(yīng)藥物或生理鹽水。所有干預(yù)于5h內(nèi)完成，同溫空氣中待醒后，放回原籠，常溫喂養(yǎng)。P15-P29行平衡實驗、P21-P27行懸吊實驗，P30-P

4、35行新物體識別實驗，P37-P42行Morris水迷宮實驗，觀測各組大鼠感覺運動功能及學(xué)習(xí)記憶功能；水迷宮實驗結(jié)束后處死，以4％多聚甲醛灌流取腦，行腦形態(tài)組織學(xué)測評，取出雙側(cè)大腦，觀察、稱重，分離左側(cè)海馬行病理切片（HE染色），觀察、計數(shù)海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)椎體層存活神經(jīng)元，反映左側(cè)大腦組織的損傷程度；另取SD大鼠120只，隨機分為10組（n=12），同法建模干預(yù)，24h后處死，迅速分離左腦海馬，Western-bloting法檢測

5、海馬Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、GSK-3β、p-GSK-3β表達，分光光度法檢測線粒體滲透性轉(zhuǎn)換。
　　 結(jié)果：
　　 （1）
　　 1）懸吊實驗：各組大鼠懸吊時間無顯著差異（F=0.430，P=0.916）
　　 2）平衡實驗：與對照組比較，七氟烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組實驗評分升高（P<0.01），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組實驗評分無顯著差異（

6、P>0.05）；與七氟烷后處理組比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組以及單純蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組實驗評分明顯下降（P<0.01），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組實驗評分無顯著差異（P>0.05）。
　　 3）新物體識別實驗：第0h、3h、24h識別系數(shù)，與對照組比較，七氟烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷

7、后處理組增高（P<0.01），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組無顯著差異（P>0.05）；與七氟烷后處理組比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組以及單純蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組明顯下降（P<0.05），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組無顯著差異（P>0.05）；
　　 4）Morris水迷宮實驗：① 定位航行實驗：平均

8、逃逸潛伏期，與對照組比較，七氟烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組明顯縮短（P<0.05），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組則無顯著差異（P＞0.05）；與七氟烷后處理組比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組以及單純蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組明顯延長（P<0.05），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組實驗評分無顯

9、著差異（P>0.05）；游泳軌跡，七氟烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組以直線式或趨向式為主，三者無顯著差異（P>0.05）；而對照組、側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組、單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組以邊緣式或隨機式為主。② 空間探索實驗：大鼠在原平臺象限的探索時間、探索路程及穿臺次數(shù)，與對照組比較，七氟烷后處理

10、、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組明顯延長（P<0.01），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組則無顯著差異（P>0.05）；與七氟烷后處理組比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組以及單純蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組明顯縮短（P<0.01），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組無顯著差異（P>0.05）；探索游泳速度，各組大鼠

11、間無顯著差異（F=0.504，P=0.869）。
　　 5）腦大體觀察：①大體損傷程度，與對照組重度損傷多見，七氟烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組較之明顯減輕（P=0.007；P=0.002；P=0.002），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組則較之無顯著差異（P=1.000；P=0.679）；與七氟烷后處理組以輕度損傷為主比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七

12、氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組以及單純蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組較之明顯加重（P=0.015；P=0.041；P=0.022），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組損傷程度無顯著差異（P=0.192；P=0.192）；② 左右腦組織重量與腦萎縮率，與對照組比較，七氟烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組重量明顯增加而腦萎縮率下降（P<0.01），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組則無顯著差

13、異（P>0.05）；與七氟烷后處理組比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組以及單純蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組重量明顯減輕而腦萎縮率升高（P<0.05），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組無顯著差異（P>0.05）。
　　 6）HE染色海馬神經(jīng)元計數(shù)：左右側(cè)海馬各自CA1區(qū)及CA3區(qū)椎體層存活神經(jīng)元數(shù)量均表現(xiàn)為，與對照組比較，七氟

14、烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組明顯增多（P<0.01），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組則無顯著差異（P>0.05）；與七氟烷后處理組比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組、單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組明顯減少（P<0.01），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組無顯著差異（P＞0.05）；側(cè)腦室注射L-N

15、AME聯(lián)合七氟烷后處理組明顯高于側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組（CA1：P=0.037；CA3：P=0.042）。
　　 （2）
　　 1）相對于對照組，七氟烷后處理能激活PI3K通路誘導(dǎo)Akt、eNOS、GSK-3β磷酸化增加（P<0.05）；相對于七氟烷后處理組，PI3K抑制劑LY294002、eNOS抑制劑L-NAME、以及GSK-3β抑制劑SB216763則能完全阻斷七氟烷后處理誘導(dǎo)的磷酸化Akt、

16、eNOS、GSK-3β表達增加（P<0.05），并使之喪失對HIBD新生大鼠的神經(jīng)保護作用；
　　 2）代表線粒體滲透性轉(zhuǎn)換程度的540nm 光密度值下降值(△OD540)，相對于對照組，七氟烷后處理、單純環(huán)孢霉素A及環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組中明顯降低（P<0.01），而單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組則無顯著差異（P＞0.05）；與七氟烷后處理組比較，側(cè)腦室注射LY294002聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射L-NAME

17、聯(lián)合七氟烷后處理組、側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組、單純蒼術(shù)苷及蒼術(shù)苷聯(lián)合七氟烷后處理組明顯減少（P<0.05），而環(huán)孢霉素A聯(lián)合七氟烷后處理組無顯著差異（P>0.05）；側(cè)腦室注射L-NAME聯(lián)合七氟烷后處理組明顯低于側(cè)腦室注射SB216763聯(lián)合七氟烷后處理組（P＜0.05）。蒼術(shù)苷能阻斷（P<0.05）、而環(huán)孢霉素 A 未能增強（P>0.05）七氟烷后處理的神經(jīng)保護作用。
　　 結(jié)論：（1）七氟烷后處理能夠減