T4對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷腦組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α表達(dá)的調(diào)節(jié)及機(jī)制.pdf

1、研究背景與目的：
　　新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)，定義為發(fā)生于圍產(chǎn)期的窒息所引起的缺氧、腦血流減少或短期腦血流灌注中斷所致的腦缺氧缺血性損傷，呈現(xiàn)一系列中樞神經(jīng)異常的臨床癥狀與體征，是引起急性圍生期死亡和遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的重要原因之一。因此，缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)的防治策略和干預(yù)機(jī)制一直以來是臨床

2、醫(yī)生和研究人員關(guān)心的問題。在新生兒缺氧缺血性腦損傷時(shí)，一系列基因轉(zhuǎn)錄活化從而引發(fā)保護(hù)性或有害性反應(yīng)，其中保護(hù)性的反應(yīng)包括刺激紅細(xì)胞生成、抗凋亡及血管形成等，有害性的反應(yīng)包括凋亡和壞死，介導(dǎo)這些基因轉(zhuǎn)錄的一個(gè)關(guān)鍵因子是缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)。生理情況下，HIF-1α參與了早期腦發(fā)育和神經(jīng)元祖細(xì)胞的增殖。在HIBD時(shí)，HIF-1α蛋白穩(wěn)定性增加，并和HIF-1β二聚體化形成

3、HIF-1，隨后作用于靶基因缺氧反應(yīng)元件調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子、葡萄糖載體蛋白-1、促紅細(xì)胞生成素等的表達(dá)而發(fā)揮腦保護(hù)作用。所以，探尋上調(diào)HIF-1α表達(dá)的藥物，將為HIE提供一個(gè)重要的治療靶向。有研究表明，部分中、重度HIE存在著甲狀腺功能減低，使用左甲狀腺素片干預(yù)可促使HIE的恢復(fù)。迄今為止，國內(nèi)未見甲狀腺素(thyroxine，T4)影響HIF-1α表達(dá)的研究，國外T4對(duì)HIF-1α表達(dá)影響的研究較少，并且研究對(duì)象多為體外的細(xì)胞，牽

4、涉到的機(jī)制多為甲狀腺素可以通過激活三磷酸肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/Akt，PI3K/Akt)信號(hào)通路，使磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α表達(dá)。然而國內(nèi)外均未見在HIBD腦組織中有T4對(duì)HIF-1α表達(dá)影響及其相關(guān)機(jī)制的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦損傷模型，甲狀腺素作為干預(yù)藥物，檢測大鼠腦組織內(nèi)的HIF-1α蛋白、mRNA及p-Akt蛋白表達(dá)。旨在探

5、討T4對(duì)新生大鼠HIBD腦組織HIF-1α表達(dá)的影響及可能的作用途徑，為臨床上應(yīng)用T4干預(yù)HIE提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　材料和方法：
　　64只健康7日齡清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，體質(zhì)量12～16g，按隨機(jī)原則分為:假手術(shù)組、模型對(duì)照組(M)、溶劑干預(yù)組和T4干預(yù)組(T4)，每組分別有16只（即n=16）。
　　模型對(duì)照組:首先鈍性分離并結(jié)扎新生大鼠左邊的頸總動(dòng)脈，放回母鼠旁1小時(shí)后，把

6、新生大鼠放入自制的有機(jī)玻璃缺氧艙中，充以氮氧混合氣(92％N2、8％O2)，時(shí)間為2小時(shí);假手術(shù)組:僅僅鈍性分離左側(cè)的頸總動(dòng)脈，但不進(jìn)行后續(xù)的結(jié)扎及缺氧處理;從HIBD模型制作成功后的當(dāng)日開始，T4干預(yù)組和溶劑干預(yù)組均通過腹腔注射的干預(yù)方式，分別給予2ug/100gT4溶液和相同體積溶劑（指溶解甲狀腺素粉末所需的堿性乙醇溶劑，具體見正文部分的甲狀腺素溶液的配備），每天1次，一共5天。
　　各組大鼠飼養(yǎng)至P11（出生當(dāng)天記為P0）時(shí)

7、，每組隨機(jī)均取8只，經(jīng)乙醚吸入方式，適度麻醉后，從左心室先后灌注約40mL生理鹽水及約40ml40g/L的甲醛，然后開顱取腦，再用40g/L甲醛室溫條件下固定24～48h，隨后進(jìn)行脫水和透明，然后石蠟包埋，接著切片，切片厚度取3μm，行免疫組化檢測所有組大鼠腦組織中p-Akt和HIF-1α的蛋白表達(dá)情況;每組另外隨機(jī)各取8只，經(jīng)乙醚吸入麻醉之后，開顱取腦，在冰袋上快速的分離左側(cè)的新生大鼠的腦皮質(zhì)，迅速置入液氮，以備RT-PCR用，檢測所

8、有組的新生大鼠左邊的腦皮質(zhì)內(nèi)HIF-1αmRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、免疫組化結(jié)果顯示:HIF-1α及p-Akt蛋白細(xì)胞分布主要在腦皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)細(xì)胞，他們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的具體定位不同，其中，HIF-1α多數(shù)在細(xì)胞核，少數(shù)在細(xì)胞質(zhì)，而p-Akt主要在神經(jīng)元的胞漿內(nèi)和胞膜上。
　　2、假手術(shù)組大腦皮質(zhì)p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達(dá)水平依次為8.080±0.369、38.581±2.846

9、，0.174±0.015;模型對(duì)照組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達(dá)水平依次為50.168±4.259、72.795±6.121、0.448±0.035;溶劑干預(yù)組大腦皮質(zhì)p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達(dá)水平依次為52.199±3.850、78.481±5.080、0.439±0.035;上述p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達(dá)水平，模型對(duì)照組較假手

10、術(shù)組升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，而模型對(duì)照組與溶劑干預(yù)組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　3、T4干預(yù)組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表達(dá)水平依次為82.765±6.271、117.350±9.374及0.618±0.042，較模型對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　4、在模型對(duì)照組及T4干預(yù)組，HIF-1α與p-Akt蛋白的表達(dá)水平均呈