鈣離子結合蛋白基因GhCaM7和GhAnn2在棉花纖維伸長中的功能分析.pdf

1、棉花纖維的伸長決定著纖維的質量和產量。對棉花伸長相關基因的發(fā)掘和及其分子機理的研究具有重要意義。雖然利用表達譜和其他功能基因組手段找到一些對棉花纖維發(fā)育相關的關鍵基因，但是這些基因在纖維發(fā)育中的作用機理還很不清楚。在本實驗室涂禮莉老師構建的海島棉全生育期纖維cDNA文庫中，我們找到兩個在纖維伸長時期高豐度表達的鈣離子結合蛋白基因GhCaM7（陸地棉鈣調素7）和GhAnn2（陸地棉膜聯(lián)蛋白2），并通過轉基因、細胞生物學、藥理學和電生理學等

2、手段對這兩個基因在纖維發(fā)育中的功能做了一定的闡述。具體結果如下:
　　1、GhCaM7(TC232366)在發(fā)育中的纖維中高量表達，且其表達豐度在所有鈣調素成員中最高。
　　通過搜索DFCI棉花EST數(shù)據(jù)庫中找到7個陸地棉鈣調素家族成員基因。RT-PCR的結果顯示有三個成員TC232366、TC244650和TC256165在纖維中有較高量的表達。進一步通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)TC232366(GhCaM7)在纖維中的表達豐度

3、較另外兩個鈣調素更高。GhCaM7在纖維發(fā)育中的表達跟纖維頂端鈣離子流入速度趨勢一致，并且這個基因在無纖維突變體胚珠中表達較正常陸地棉品系低，這些結果說明，GhCaM7可能在纖維發(fā)育中起著重要作用。
　　2、GhCaM7對早期纖維的發(fā)育有促進作用。
　　將GhCaM7在35S啟動子驅動下進行超量表達和RNA特異干涉。表型鑒定結果顯示，超量表達GhCaM7能夠促進纖維早期的伸長而不是后期，而抑制GhCaM7的表達會使纖維的突起

4、延遲且纖維的伸長也會受到抑制。另外，體外胚珠培養(yǎng)實驗結果也同樣顯示，胚珠在BT培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天后，GhCaM7超量表達的纖維明顯長于野生型，而干涉纖維明顯短于野生型。用鈣調素的拮抗劑TFP（三氟拉嗪）處理培養(yǎng)中的胚珠，纖維發(fā)育也明顯受到抑制。這些結果都說明GhCaM7對早期纖維發(fā)育有促進作用。
　　3、GhCaM7能通過調控ROS的產生來促進纖維早期發(fā)育。
　　通過外源添加雙氧水和鈣饑餓誘導實驗，發(fā)現(xiàn)一定量的活性氧在纖維伸

5、長中都能起到正調控的作用。我們通過活性氧定性和雙氧水定量實驗檢測了GhCaM7轉基因材料纖維和胚珠中的ROS水平。結果發(fā)現(xiàn)，GhCaM7超表達促進了ROS的積累，而GhCaM7干涉材料中ROS水平明顯比野生型低。同時利用胚珠培養(yǎng)體系對轉基因和野生型胚珠進行了雙氧水和DPI（活性氧抑制劑）的處理，結果也表明GhCaM7可能在ROS的上游行使功能。
　　4、ROS對GhCaM7的表達也有調控作用。
　　通過非損傷微測技術和胚珠培

6、養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)雙氧水能促進鈣離子的內流和鈣庫鈣離子的釋放。qRT-PCR結果顯示外源雙氧水也能誘導GhCaM7的表達，這說明ROS可以引發(fā)鈣離子的內流來增加細胞內鈣離子濃度，這樣就進一步激活GhCaM7的表達。另外，鈣庫鈣離子釋放通道抑制劑的處理實驗也顯示鈣饑餓的條件下，ROS的水平受到誘導上升，從而促進內源鈣庫的鈣離子的釋放，進而上調GhCaM7的表達，進一步證明ROS可以調節(jié)GhCaM7的表達。
　　5、GhCaM7在IAA誘導的

7、纖維伸長中起著積極作用。
　　qRT-PCR分析結果表明GhCaM7可以被IAA誘導表達。隨后利用胚珠培養(yǎng)體系進一步考察GhCaM7和IAA的關系時發(fā)現(xiàn)，當BT培養(yǎng)基中不加IAA或加入NPA（IAA運輸抑制劑）時，培養(yǎng)的轉基因株系和野生型株系纖維長度沒有顯著差別。而當BT培養(yǎng)基中加入TFP之后，IAA促進纖維伸長的效果被明顯削弱。由此看來，GhCaM7在IAA誘導的纖維伸長中起著積極的作用。而GhCaM7只有在IAA存在的條件下才

8、能更好的在纖維發(fā)育中行使作用。
　　6、GhCaM7與IAA協(xié)同調控ROS產生
　　5μMIAA處理胚珠能顯著促進纖維伸長，也能誘導ROS的產生。而ROS抑制劑能顯著減弱IAA對纖維伸長的促進效果。這說明IAA可能在一定程度上通過ROS來影響纖維伸長。胚珠ROS熒光染色結果顯示，TFP可以明顯減弱IAA誘導的ROS的產生。同時在IAA存在條件下，GhCaM7水平越高ROS產生越多，而在IAA少量存在或沒有的條件下，GhCaM

9、7不能更好的促進ROS的產生。而減弱鈣調素作用，IAA同樣也不能很好的產生ROS。這說明GhCaM7和IAA協(xié)同調控ROS的產生。
　　7、GhAnn2在發(fā)育中的纖維中高量表達，并在纖維伸長期有表達高峰。
　　生物信息學分析發(fā)現(xiàn)GhAnn2可能來自D基因組。將D基因組所有的膜聯(lián)蛋白基因找出來并對他們進行RT-PCR和qRT-PCR分析，結果發(fā)現(xiàn)有7個膜聯(lián)蛋白基因家族成員在纖維中有表達，其中GhAnn2在纖維快速伸長期有表達高

10、峰。
　　8、GhAnn2下調表達抑制纖維伸長和細胞壁的合成
　　對GhAnn2干涉株系進行纖維長度和細胞壁厚度的考查結果顯示GhAnn2干涉株系各個發(fā)育時期纖維較野生型顯著變短且成熟纖維細胞壁顯著變薄。qRT-PCR分析表明一些纖維伸長和次生壁合成相關基因在干涉纖維中表達下調。這說明GhAnn2是纖維正常發(fā)育所必需的。
　　9、GhAnn2干涉纖維頂端鈣離子流入減弱
　　非損傷微測技術測定纖維頂端鈣離子流發(fā)現(xiàn)，

11、GhAnn2被干涉后，纖維頂端的鈣離子流呈外流狀態(tài)，而野生型纖維頂端鈣離子呈正常的內流狀態(tài)。這說明GhAnn2干涉后纖維頂端的鈣離子內流減弱。另外用鈣離子通道抑制劑La3+處理離體培養(yǎng)的胚珠發(fā)現(xiàn)GhAnn2干涉的纖維對La3+更加敏感。由此推測，GhAnn2的表達下調使得纖維頂端鈣離子內流減弱導致細胞內鈣離子濃度變小，從而對鈣離子通道抑制劑更加敏感。
　　10、GhAnn2的抑制表達擾亂纖維細胞中鈣離子信號的傳遞
　　由于G