松褐天牛氣味結(jié)合蛋白基因的克隆與功能分析.pdf

1、松褐天牛Monochamus alternatus Hope是松材線蟲病的主要傳播媒介，控制松褐天牛是有效治理松材線蟲病的方法。氣味結(jié)合蛋白(OBPs)是氣味分子與氣味受體之間的媒介，在昆蟲識(shí)別信息化學(xué)物質(zhì)的過程中起著重要的作用，但松褐天牛氣味結(jié)合蛋白的具體功能仍不明確。為明確MaltOBPs在松褐天牛嗅覺感受中的功能及篩選松褐天牛行為活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)，我們構(gòu)建了松褐天牛觸角轉(zhuǎn)錄組，篩選并克隆5個(gè)MaltOBPs基因，分析了5個(gè)Malt

2、OBPs基因的時(shí)空表達(dá)與行為的相關(guān)性，測(cè)定了重組MaltOBPs與18種寄主植物揮發(fā)物的熒光結(jié)合特性及與pH值的相關(guān)性。主要取得如下研究結(jié)果:
　　1.松褐天牛觸角轉(zhuǎn)錄組的構(gòu)建
　　選取松褐天牛雌雄蟲成蟲觸角構(gòu)建了松褐天牛觸角轉(zhuǎn)錄組。經(jīng)過測(cè)序、原始序列處理、聚類和拼接共獲得85，869條contigs序列，平均長(zhǎng)度為297bp;獲得37，242條unigenes序列，平均長(zhǎng)度為669bp。NR注釋的結(jié)果表明，94.3％的un

3、igenes與赤擬谷盜Tribolium castaneum(Herbst)和中歐山松大小蠹Dendroctonusponderosae Hopkins的unigenes相似性最高。對(duì)unigenes按照COG功能注釋，可分為25個(gè)功能群，其中一般功能預(yù)測(cè)類，復(fù)制、重組和修復(fù)類包含的unigenes個(gè)數(shù)最多，分別為3，051條和1，349條。
　　對(duì)松褐天牛觸角轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)一步篩選比對(duì)，共獲得OBPs基因全長(zhǎng)序列25條，片段序列4

4、條;化學(xué)感受蛋白(CSPs)全長(zhǎng)序列8條，片段序列4條;氣味受體(ORs)全長(zhǎng)序列1條，片段序列8條;1條感覺神經(jīng)元膜蛋白(SNMPs)全長(zhǎng)序列。
　　2.松褐天牛MaltOBPs基因的克隆及序列分析
　　通過RT-PCR技術(shù)成功克隆了松褐天牛MaltOBP9、MaltOBP10、MaltOBP19、MaltOBP21、MaltOBP24基因(GenBank登錄號(hào)分別為:KF977562、KF977563、KF977572、

5、KF977574、KF977577)，開放閱讀框分別為423、435、615、390、510bp，各編碼140、144、204、129、169個(gè)氨基酸，分別有19、25、18、18、0個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽;其中MaltOBP9和MaltOBP21屬于Minus-C OBPs，MaltOBP10屬于Classic OBPs，MaltOBP19和MaltOBP24屬于Plus-C OBPs;系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，Classic OBPs家族、Mi

6、nus-C OBPs家族和Plus-C OBPs家族分枝明顯。
　　3.松褐天牛MaltOBPs基因的時(shí)空表達(dá)譜
　　通過qPCR檢測(cè)松褐天牛5個(gè)MaltOBPs基因的時(shí)空表達(dá)情況。結(jié)果表明，這5個(gè)MaltOBPs基因在雌雄蟲下唇須和下顎須的表達(dá)量普遍較高，在觸角、頭、足、腹和翅也有一定的表達(dá);且這5個(gè)MaltOBPs基因在觸角中的表達(dá)量因成蟲齡期、性別和交配狀態(tài)的不同而呈現(xiàn)差異。
　　4.松褐天牛MaltOBPs的原

7、核表達(dá)、純化及結(jié)合特性
　　成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET20b-MaltOBP9、pET20b-MaltOBP10、pET20b-MaltOBP19、 pET17b-MaltOBP24、 pGEX-6P-1-MaltOBP21。pGEX-6P-1-MaltOBP21在上清中表達(dá)，通過GST4B親和層析柱和Precission protease酶切獲得MaltOBP21純蛋白;pET20b-MaltOBP9、pET20b-MaltOBP

8、10、pET20b-MaltOBP19、pET17b-MaltOBP24主要在包涵體中表達(dá)，經(jīng)過包涵體變復(fù)性、DE52弱陰離子交換柱及QFF強(qiáng)陰離子交換層析柱獲得純蛋白。
　　選擇1-NPN為熒光探針，利用熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定這5個(gè)MaltOBPs在中性和酸性pH環(huán)境下與18種寄主植物揮發(fā)物單體的結(jié)合特性，它們?cè)谥行詐H環(huán)境下與揮發(fā)物的結(jié)合能力普遍高于酸性pH環(huán)境。在中性條件下，2個(gè)屬于Minus-COBPs家族的MaltOBPs

9、對(duì)其中4種揮發(fā)物都表現(xiàn)出較強(qiáng)的結(jié)合能力;2個(gè)屬于Plus-C OBPs家族的MaltOBPs結(jié)合特性方面表現(xiàn)比較大的差異，其中一個(gè)MaltOBPs對(duì)17種揮發(fā)物均表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合力，而另一個(gè)MaltOBPs僅對(duì)5種揮發(fā)物表現(xiàn)強(qiáng)結(jié)合力。屬于Minus-C OBPs，Classic OBPs，Plus-C OBPs家族的5個(gè)MaltOBPs結(jié)合特性之間并未表現(xiàn)出明顯的特征。
　　本研究為明確松褐天牛氣味結(jié)合蛋白的功能，研制行為調(diào)節(jié)劑以及明