柞蠶蛋白激酶C受體1基因的鑒定與表達(dá)分析.pdf

1、分類號：單位代碼：10364密級：學(xué)號：12720440安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文柞蠶柞蠶蛋白激酶蛋白激酶C受體受體1基因的鑒定與基因的鑒定與表達(dá)分析表達(dá)分析IdentificationexpressionanalysisofreceptfactivatedCkinase1fromsilkproducinginsectAntheraeapernyi研究生：于皓指導(dǎo)教師：劉朝良教授合作指導(dǎo)教師：朱保建副教授申請學(xué)位門類級別：理學(xué)碩士

2、專業(yè)名稱：生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究方向：昆蟲生化與分子生物學(xué)所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會主席：二零一五年六月摘要蛋白激酶C受體l(receptfactivatedCkinase1，RACKl)是WD40家族的成員，它不僅可以做為穩(wěn)定蛋白激酶C(proteinkinasesCPKC)的受體，可以在多個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起到重要的調(diào)控作用。而且還可以通過和其他蛋白相結(jié)合，協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的各項(xiàng)生理活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)通過特異性引物的設(shè)計(jì)，在PCR克隆

3、，測序，獲得柞蠶蛋白激酶C受體1基因的正確讀碼框序列。測得該基因讀碼框全長為960bp，對319個(gè)氨基酸進(jìn)行編碼。對其蛋白分子量預(yù)測為35.88kDa。通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，柞蠶RACK1氨基酸序列與小菜蛾等鱗翅目昆蟲的同源性較高，普遍在95%以上。將克隆所得目的片段與質(zhì)粒pET28a表達(dá)載體相連接，得重組質(zhì)粒pET28aRACK1，將其轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，對蛋白采用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)蛋白電泳和蛋白免疫印跡分

4、析表明，所需目的蛋白得到正確誘導(dǎo)的表達(dá)，分子量大小在36kDa左右。重組蛋白進(jìn)行純化用本實(shí)驗(yàn)室NiNTA親和層析柱。并且用純化的蛋白為抗原，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體?？贵w效價(jià)經(jīng)ELISA檢測，達(dá)到1：20000。提取柞蠶卵、幼蟲，蛹、成蟲四個(gè)階段對RACK1進(jìn)行時(shí)序表達(dá)分析，結(jié)果表明在四個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，表達(dá)情況不一，成蟲期表達(dá)量相對較高，卵期較低。分別提取柞蠶幼蟲五齡第三天的脂肪體，馬氏管，血液，中腸，表皮5個(gè)不同組織的總RNA和

5、總蛋白分析柞蠶RACK1在不同組織中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柞蠶RACK1在所取五種組織中均有表達(dá)，表達(dá)量相對較高在脂肪體和馬氏管中。選取五齡第三天的柞蠶幼蟲，分別注射核型多角體病毒（病毒），白僵菌（真菌），大腸桿菌（細(xì)菌）三種病原微生物進(jìn)行免疫刺激，并提取1.536122448h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)脂肪體和馬氏管的RNA和總蛋白。通過熒光定量和蛋白免疫印跡法分析柞蠶RACK1經(jīng)過免疫刺激后，在不同的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量的變化。通過對柞蠶進(jìn)行病原微生物刺

6、激，RACK1表達(dá)量上調(diào)且變化情況不一，注射大腸桿菌變化最為明顯，12h后RACK1表達(dá)量顯著升高在24h達(dá)到最高，但在48h顯著降低，注射白僵菌和NPV相對變化較小，在24h48h有所升高。表明RACK1可能參與到了柞蠶對外源病原微生物的免疫反應(yīng)中。柞蠶是大蠶蛾科，做為一種重要的經(jīng)濟(jì)絹絲昆蟲，在食品和藥用方面都有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。對天然柞蠶開展免疫研究，對于提高柞蠶的抗病能力，為保障養(yǎng)蠶業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。關(guān)鍵詞：柞蠶，蛋白激酶C