蛋白激酶C對mdr1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的初步研究.pdf

1、該課題通過對KBV200多藥耐藥細(xì)胞株耐藥性及P-糖蛋白(P-gp)的測定,證實KBV200細(xì)胞株是P-gp高表達(dá)的穩(wěn)定耐藥株,以該細(xì)胞株總DNA為模板,成功構(gòu)建了mdr1基因啟動子綠色熒光蛋白融合表達(dá)質(zhì)粒,為以后進(jìn)一步研究多藥耐藥的機制及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥提供了一個重要工具.同時,初步研究了PKC調(diào)節(jié)劑對KBV200細(xì)胞PKC活性、P-gp的表達(dá)以及對mdr1基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的影響.方法:實驗采用MTT法檢測敏感株KB和耐藥株KBV200

2、細(xì)胞的耐藥性(用IC<,50>表示):Western blot法檢測KBV200及其親本KB細(xì)胞株P(guān)-gp的表達(dá);<'32>P摻入法測定PKC活性;參照已公布的mdr1基因啟動子序列設(shè)計引物,以KBV200細(xì)胞株基因組為模板,應(yīng)用PCR擴增目的基因片段;通過亞克隆技術(shù)將其插入pEGFP-N<,2>報告載體中;對克隆的DNA序列進(jìn)行酶切、PCR、測序鑒定;脂質(zhì)體法將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光蛋白(green fluorescen