水稻類受體蛋白激酶OsRPK1激酶域的表達純化及體外激酶活性驗證.pdf

1、本文旨在通過異源表達系統(tǒng)表達水稻LRR型類受體蛋白激酶OsRPK1激酶域,并在體外進行其激酶活性分析,通過實驗證明其能發(fā)生自體磷酸化反應。植物類受體蛋白激酶廣泛參與植物生長發(fā)育、激素信號轉(zhuǎn)導、抗病和抗逆等途徑。類受體蛋白激酶生理作用的發(fā)揮依賴于自身的激酶活性,因此研究該類激酶的活性及發(fā)揮活性的必要因素是開展其功能研究非常重要的方面。
　　 本實驗室在前期工作中開展了鹽脅迫下水稻質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學分析,鑒定了一批鹽脅迫響應蛋白,其中包

2、括一個分子量98kDa,等電點5.93的蛋白點,在脅迫處理后表達水平顯著上調(diào)。經(jīng)水稻蛋白數(shù)據(jù)庫檢索,該蛋白為一個推測的類受體蛋白激酶,我們將其命名為OsRPK1。OsRPK1基因全長3177bp,編碼區(qū)2910bp,編碼969個氨基酸。通過生物信息學分析,推測OsRPK1是一個包括亮氨酸富集區(qū)(Leucine-Rich-Repeat,LRR)的類受體蛋白激酶。為了用實驗方法具體驗證OsRPK1能否發(fā)生自體磷酸化反應,我們設計了如下實驗:

3、首先,通過RT-PCR方法從鹽脅迫的水稻根尖組織cDNA中擴增得到OsRPK1(OSRPK1除去預測的信號肽區(qū))和OsRPK1-KD(預測的OsRPK1激酶區(qū))基因片段。利用DNA重組技術(shù),將這兩個片段分別連接到pGEX-4T-1載體上,構(gòu)建了OsRPK1和DsRPK1-KD的原核表達載體pGEx-OsRPK1和pGEX-OsRPK1-KD。將原核表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株,經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達,SD

4、S—PAGE檢測表達情況。同時,我們從pGEX-OsRPK1-KD載體上擴增了GST-OsRPK1—KD片段,并將其連接到pPICZαA載體上,構(gòu)建了酵母表達載體pPICZαA-GST-OsRPK1-KD,將該表達載體轉(zhuǎn)化酵母X-33菌株,經(jīng)甲醇誘導表達,SDS-PAGE檢測表達情況。最后,將有表達的融合蛋白,通過GST resin親和純化,與γ-32P-ATP反應,放射自顯影檢測磷酸化活性。
　　 通過以上實驗,本文成功構(gòu)建了

5、兩個原核表達載體和一個真核表達載體,其中pGEX-OsRPK1-KD能夠在大腸桿菌BL21菌株表達GST-OsRPK1-KD融合蛋白。通過GST resin親和層析,得到純化的GST-OsRPK1-KD融合蛋白。GST-OsRPK1-KD與γ-32P-ATP孵育,在Mn2+或Mg2+或者二者都存在的情況下,表現(xiàn)出蛋白激酶活性,即能夠發(fā)生自體磷酸化,同時該活性需要細胞總蛋白的參加。輔助因子二價陽離子,相比Mn2+來說,Mg2+更能激活GS