光點擊化學法構建的多功能透明質酸納米-微米凝膠用于蛋白質藥物的腫瘤靶向高效治療.pdf

1、惡性腫瘤在全世界范圍內導致的發(fā)病率逐年上升，目前臨床上治療腫瘤的主要手段包括外科手術切除、放療、化療等。其中化療是一種常用的治療手段，但腫瘤選擇性差，藥物利用率低，在殺死腫瘤的同時也會對正常組織和器官造成損傷，導致很多病人因強烈的毒副作用而難以堅持化療。蛋白質藥物因其高效、高特異性和低毒副作用的特點近年來被越來越多地用于腫瘤治療。盡管蛋白質藥物展現(xiàn)出了巨大的潛力，但其臨床應用仍受限于在體內不穩(wěn)定、容易酶降解以及難以進入腫瘤細胞內等缺點。

2、最近，多種納米和微米載體被開發(fā)用來保護蛋白質藥物的生物活性和實現(xiàn)蛋白質藥物的腫瘤靶向治療。論文第一章介紹了蛋白質藥物用于腫瘤治療的現(xiàn)狀，著重概述了用于蛋白質包載和控制釋放的各種納米載體和微米載體系統(tǒng)。
　　本論文第二章設計合成了還原響應性自發(fā)熒光的透明質酸納米凝膠(HA NGs)用于實現(xiàn)治療性蛋白質藥物(細胞色素C(CC)和顆粒酶B(GrB))的高效和高選擇性遞送。該HANGs是用透明質酸-胱胺-甲基丙烯酸酯衍生物(HA-Cys-

3、MA)和透明質酸-賴氨酸-四唑衍生物(HA-Lys-Tet)經(jīng)反相納米沉淀法和“四唑-烯”光點擊化學交聯(lián)法制備得到。動態(tài)光散射(DLS)結果顯示HA NGs粒徑較小(150nm)，PDI為0.10，表面帶負電荷(-17.6mV)。HA NGs在生理環(huán)境下和模擬血液環(huán)境中穩(wěn)定，能有效抑制包載的CC蛋白質藥物的早釋;而在模擬細胞內還原環(huán)境下(10mM GSH)可快速降解，能在10小時內快速釋放約80％的CC。而且，從納米凝膠釋放的CC表現(xiàn)出

4、了與自由CC相似的酶催化活性和二級結構。MTT結果顯示，包載GrB的納米凝膠(GrB-NGs)能夠有效靶向并且殺死CD44過表達的MCF-7乳腺癌細胞和A549肺癌細胞，其IC50比臨床上廣泛使用的化療藥物低了幾千倍。體內抗腫瘤實驗表明GrB-NGs在極低劑量(3.8-5.7nmol GrB equiv./kg)時就能有效抑制皮下MCF-7乳腺癌和原位A549-luciferase肺癌的生長，同時不會帶來明顯的毒副作用。該納米凝膠具有高

5、穩(wěn)定性、還原敏感性、良好的腫瘤靶向性和自發(fā)熒光等優(yōu)點，在蛋白質藥物的細胞內高效遞送方面有很好的應用前景。
　　為進一步提高納米凝膠載體的腫瘤選擇性和內吞進入腫瘤細胞的能力，本論文第三章設計了EGFR和CD44雙重靶向的生物響應性自發(fā)熒光的透明質酸納米凝膠(EGFR/CD44-NGs)用來增強治療性蛋白質藥物GrB在卵巢癌和乳腺癌的靶向遞送。EGFR/CD44-NGs由透明質酸-四唑衍生物(HA-g-Tet)，透明質酸-四唑/GE1

6、1多肽衍生物(HA-g-GE11/Tet)以及透明質酸-胱胺-甲基丙烯酸酯衍生物(HA-g-Cys-MA)通過聯(lián)用反相納米沉淀法和“四唑-烯”光點擊化學法制得。EGFR/CD44-NGs可定量包載CC和GrB，粒徑較小(約165nm)，在血清中穩(wěn)定，而在還原條件下快速釋放包載的蛋白質藥物。流式結果顯示EGFR/CD44-NGs內吞進入CD44/EGFR高表達的SKOV-3細胞的量是CD44-NGs單靶向實驗組的6倍多。同樣，GrB-EG

7、FR/CD44-NGs相比于GrB-CD44-NGs能更好地激活SKOV-3腫瘤細胞內的caspase，更有效地抑制細胞的生長。體內抗腫瘤實驗表明GrB-EGFR/CD44-NGs在3.85nmol GrB equiv./kg的低劑量條件下幾乎完全抑制了皮下SKOV-3卵巢癌和MDA-MB-231乳腺癌腫瘤的生長，而且未引起明顯的毒副作用。該治療效果明顯優(yōu)于單靶向的GrB-CD44-NGs。因此，EGFR和CD44雙靶向的多功能透明質酸

8、納米凝膠能顯著增強蛋白質納米藥物內吞進入腫瘤細胞的能力，進而提高蛋白質藥物的抗腫瘤效果。
　　腫瘤轉移是造成大部分癌癥患者死亡的主要原因。在第四章，用雙靶向EGFR/CD44-NGs包載蛋白質藥物皂草毒素(Sap)，并詳細研究了載Sap的納米凝膠(Sap-EGFR/CD44-NGs)對4T1-luciferase(4T1-luc)轉移性乳腺癌的體內治療效果。流式結果顯示EGFR/CD44-NGs內吞進入CD44/EGFR高表達的4

9、T1-luc細胞的量是CD44-NGs單靶向實驗組的6.2倍。MTT結果顯示Sap-EGFR/CD44-NGs能有效地抑制4T1-luc細胞的生長，其半致死濃度(IC50)為5.36nM，這遠遠小于單靶向的Sap-CD44-NGs(14.4nM)。體內抗腫瘤實驗表明Sap-EGFR/CD44-NGs在低劑量(13.3nmol Sap equiv./kg)的條件下有效抑制了4T1-luc腫瘤在肺部的轉移和生長，并且未表現(xiàn)出明顯的毒副作用。

10、這證明了該雙靶向納米凝膠在包載治療性蛋白質藥物后，可高效抑制腫瘤的轉移和生長。
　　在第五章，設計制備粒徑均一的透明質酸微凝膠(HMGs)，來實現(xiàn)赫賽汀(Herceptin)在卵巢癌的局部長效釋放。HMGs由透明質酸的甲基丙烯酸-2-氨基乙酯衍生物(HA-AMA)和透明質酸的二甲氨基四唑衍生物(HA-MTet)經(jīng)微流控法和“四唑-烯”光點擊化學交聯(lián)法制備得到。通過簡單調節(jié)水相油相速度，可方便制備得到大小均一、粒徑在25-50μm的

11、微凝膠。HMGs在透明質酸酶的作用下會降解，并且降解速率隨透明質酸酶濃度的增加而加快。HMGs能高效包載Herceptin和IgG蛋白藥物，包載量可高達27.2wt.％。體外釋放實驗表明HMGs可實現(xiàn)Herceptin和IgG的長效可控釋放，在1U/mL的透明質酸酶的條件下，Herceptin蛋白藥物在10天時的釋放量為80.6％。圓二色譜(CD)測試顯示從微凝膠中釋放出的Herceptin和IgG蛋白質具有與自由蛋白質相似的二級結構。