內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子CHOP在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是嚴(yán)重創(chuàng)傷、擠壓綜合征以及多種疾病所導(dǎo)致的臨床急危重癥，一旦發(fā)生急性腎衰竭(acute renAlfailure，ARF)，死亡率高達(dá)40％～60％。缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是急性腎損傷的重要原因之一，炎癥反應(yīng)是缺血再灌注引起急性腎損傷的重要機(jī)制。腎小管上皮細(xì)胞作為缺血再灌注損傷關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，是腎組織炎癥介質(zhì)的主要來(lái)源。核因子-κ B(nu

2、clear factor κ B, NF-κ B)是調(diào)控炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在引發(fā)炎癥瀑布效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。盡管研究發(fā)現(xiàn)NF-κ B與急性I/R 腎損傷炎癥發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，但抑制其活性并不能完全阻斷腎組織炎性損傷。因此，進(jìn)一步揭示I/R 引起腎組織炎癥反應(yīng)失控的途徑，對(duì)探明急性腎損傷發(fā)生機(jī)制和制定新的防治措施具有重要意義。
　　 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最大的細(xì)胞器，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起重要作用。缺氧、低糖以及能量匱乏等

3、因素均可引起過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。已證實(shí)，過(guò)度ERS不僅是缺血性心、腦組織損傷的重要機(jī)制，也與急、慢性炎癥疾病密切相關(guān)。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，I/R 可引起腎組織過(guò)度ERS，但其在缺血再灌注腎損傷中的作用與機(jī)制尚不明確。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子，屬C/EBP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員，它是ERS信號(hào)途徑中調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因子。最新研究發(fā)現(xiàn)，急性肺炎、胰腺炎和結(jié)腸炎

4、動(dòng)物模型中，chop基因敲除小鼠caspase-11mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少、caspase-1活性顯著降低、巨噬細(xì)胞和炎癥細(xì)胞TNF-α和IL-1β浸潤(rùn)明顯減少，提示CHOP-炎性caspase 途徑在急性炎癥疾病中具有重要作用。已證實(shí)，IL-1β是炎癥反應(yīng)早期產(chǎn)生的前炎癥細(xì)胞因子，炎性caspase 負(fù)責(zé)剪切IL-1β前體成為成熟的IL-1β，而活化的IL-1β
　　 反過(guò)來(lái)通過(guò)激活NF-κ B 放大炎癥瀑布效應(yīng)。據(jù)此，我

5、們推測(cè)，CHOP通過(guò)炎性caspase途徑在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控IL-1β活化可能是缺血再灌注腎損傷炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制。
　　 本課題通過(guò)建立大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E的缺氧復(fù)氧(hypoxiareoxygenation，H/R)損傷模型,探明CHOP-caspase 途徑在缺血再灌注腎損傷炎癥反應(yīng)中的作用與機(jī)制，為闡明急性缺血性腎損傷發(fā)生機(jī)制以及尋找新的治療策略提供科學(xué)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 1.細(xì)

6、胞培養(yǎng)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)用含5％胎牛血清的DMEM 液于37 ℃、5％CO2和95％空氣的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　 2.缺氧復(fù)氧細(xì)胞模型的制備當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)95％時(shí)用無(wú)血清DMEM 同步化細(xì)胞24 h，換用無(wú)血清無(wú)抗生素磷酸鹽緩沖液于37 ℃、含有1％(體積分?jǐn)?shù))O2+94％ N2+5％CO2混合氣的37 ℃缺氧箱(Modular Incubator Chamber)中缺氧4 h。復(fù)氧時(shí)，將培養(yǎng)液換為正常培養(yǎng)

7、基，于37 ℃、5％ CO2+95％空氣的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1、3、6、12、24 h，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液上清。
　　 3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染NRK-52E 以105/孔傳代于六孔板，培養(yǎng)于含5％FBS不含抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中，在37 ℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)至密度達(dá)50％-60％。分別以5 μL 脂質(zhì)體Lipofecta mine?
　　 2000加8 μL對(duì)照 siRNA 或8 μL CHOP siRNA 轉(zhuǎn)染NRK-52E細(xì)

8、胞24 h，進(jìn)行缺氧復(fù)氧12 h。采用RT-PCR和Western blot方法評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。
　　 4.細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn)分為兩大組:正常對(duì)照組、H/R1h組、H/R3 h組、H/R6 h組、H/R12 h組、H/R24 h組；正常對(duì)照組、對(duì)照 siRNA組、CHOP siRNA組、H/R12 h組、對(duì)照siRNA+H/R12 h組和CHOP siRNA+H/R12 h組。
　　 5. 檢測(cè)指標(biāo)與方法5.1細(xì)胞活力測(cè)定常規(guī)生

9、化方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(lactic acid dehydrogenase,LDH)的含量。
　　 5.2 RT-PCR 法檢測(cè)細(xì)胞caspase-11、caspase-1以及IL-1βmRNA表達(dá)水平TRIZOL 法提取各組細(xì)胞總RNA，在20μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),以cDNA為模板,進(jìn)行核酸定量。以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，引物序列如下：chop上游5'GGGAAACAGCGCATGAAGGA3'，下游

10、5'GCGTGATGGTGCTGGGTACA3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為221bp；caspase-11上游5'ACGGCTGAGGGCATGGAATC3'，下游5'AGGCCTGCACAATGATGACTTT3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為235 bp；caspase-1上游5'TCGGGAGTATGGGAAGGTTGAG 3'，下游5'TCCCTTATCCAAAATGCATGCTA 3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為290bp；IL-1β上游 5'CGTGGCACATTCTGG

11、TCAAA3'，下游5'CTCGTGACCCCCCTGAATC3'擴(kuò)增產(chǎn)物為220bp；β-actin上游5'ACCCCGTGCTGCTGACCGAG3'，下游5'TCCCGGCCAGCCAGGTCCA3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為249 bp。采用20μL 反應(yīng)體系在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:預(yù)變性94 ℃5 min后,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)：變性94 ℃30s，退火57 ℃
　　 30s，延伸72 ℃

12、45 s。對(duì)PCR 反應(yīng)過(guò)程中每一循環(huán)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),獲得Ct (cyclethreshold)值。采用RT-PCR 相對(duì)定量方法對(duì)2-ΔΔ Ct 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 5.3 Western blot 法檢測(cè)GRP78、CHOP、caspase-11、caspase-1以及IL-1β蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞, 提取蛋白, 考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度。將含有50μg總蛋白的提取液與4×SDS 加樣緩沖液混勻, 100℃加熱7 mi

13、n 變性,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上；5％脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗GRP78(1:1000)、CHOP(1：
　　 200)、caspase-11(1：200)、caspase-1(1：1000)、IL-1β(1：200),4 ℃過(guò)夜；TBST 緩沖液漂洗10min×3次；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1：10000),室溫孵育1h；TBST緩沖液漂洗6 min×5次后, 暗室中加ECL 發(fā)光

14、試劑(Pierce 公司)，X 光膠片曝光，常規(guī)方法顯影、定影。凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參照,GRP78、CHOP、caspase-11、caspase-1、IL-1β蛋白含量分別用GRP78/β-actin、CHOP/β-actin、caspase-11/β-actin、caspase-1/β-actin、IL-1β表示。
　　 5.4 ELISA 檢測(cè)IL-1β的表達(dá)采用ELISA 試劑

15、盒檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清IL-1β水平。
　　 5.5細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞CHOP和caspase-11的表達(dá)收集細(xì)胞，PBS 漂洗3次；4％多聚甲醛固定細(xì)胞爬片30min, PBS 漂洗3次,每次5 min; 0.25％ triton X-100破膜10min，PBS 漂洗3次,每次5 min；用CHOP、caspase-11抗體分別孵育或共同孵育，4 ℃過(guò)夜;第2 d PBS 漂洗3次,每次5 min;分別用FIT

16、C 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1：20)或Cy3 標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:50) 37 ℃孵育1h, PBS 漂洗3次,每次5 min; DAPI 染液染細(xì)胞核3 min，PBS 漂洗3次,每次5 min；封片劑封片。
　　 激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并照相。
　　 結(jié)論:缺氧復(fù)氧可以激活腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，活化CHOP 放大炎癥瀑布效應(yīng)。CHOP通過(guò)炎性caspase 途徑在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控IL-1β的產(chǎn)生，在