白藜蘆醇苷對缺氧-復氧腎小管上皮細胞損傷保護作用的研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：缺氧-復氧腎小管上皮細胞損傷的信號傳導機制 目的：將人腎臟近曲小管上皮細胞株(Human renal proximaltubular epithelial cells，HK-2)為研究對象，體外人工模擬缺氧-復氧環(huán)境，探討缺氧-復氧(Hypoxia/Re-oxygenation，H/R)腎小管上皮細胞損傷的信號傳導機制。 方法：將HK-2細胞根據(jù)不同處理分為3組：對照組、缺氧-復氧組

2、(H/R組)和PDTC干預組。對照組HK-2細胞用DMEM常氧培養(yǎng)；H/R組HK-2細胞在缺氧下培養(yǎng)24小時后在常氧(復氧)下繼續(xù)培養(yǎng)24小時；PDTC干預組HK-2細胞加入PDTC后在缺氧下培養(yǎng)24小時再常氧(復氧)培養(yǎng)24小時。于缺氧6、12、24小時和缺氧24小時后復氧6、12、24小時分別獲取各組標本，應用MTT法細胞計數(shù)檢測HK-2細胞存活數(shù)，免疫組化法檢測NF-κB p65蛋白表達，逆轉錄-多聚酶鏈反應(Reverse tr

3、anscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法檢測細胞間粘附因子-1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)mRNA轉錄，酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測ICAM-1蛋白表達情況。 結果：H/R組HK-2細胞數(shù)量在缺氧6小時明顯減少，24小時達最低值(呈時間依賴性)，

4、復氧后稍有升高，與對照組各對應時間點相比均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。與對照組相比，H/R組HK-2細胞NF-κB p65陽性蛋白表達(平均光密度值)，ICAM-1mRNA表達(光密度比值)和ICAM-1蛋白濃度(pg/ml)表達在各對應時間點均明顯增高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。PDTC組HK-2細胞數(shù)量多，NF-rB p65陽性蛋白表達，ICAM-1mRNA轉錄和ICAM-1蛋白表達均降低，各對應時間點的各項檢測指標分別與H/

5、R組和對照組相比均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。Pearson相關系數(shù)r=0.82 1，P＜0.05，故可認為ICAM-1蛋白濃度與NF-κBp65陽性表達之間存在正相關關系。 結論： 1.本研究將HK-2細胞株置于無血清無糖DMEM中充以95％N2/5％CO2混合氣體進行細胞培養(yǎng)，模擬體內組織缺氧缺血再灌注環(huán)境，成功地復制了體外缺氧-復氧性HK-2細胞損傷模型。此方法操作簡單、易行、結果穩(wěn)定。 2.H/R條件下

6、HK-2細胞培養(yǎng)呈時間依賴性地激活NF-κB，促進ICAM-1mRNA轉錄及ICAM-1mRNA蛋白的表達。PDTC干預能明顯降低H/R近端腎小管上皮細胞ICAM-1mRNA轉錄和ICAM-1蛋白表達。 3.H/R導致HK-2細胞損傷的胞內信號傳導機制可能是H/R首先刺激NF-κB活化使得HK-2細胞表面ICAM-1表達增加進而促進多形核中性白細胞(Polymorphonuclear neutrophils，PMNs)的粘附。

7、 第二部分：白藜蘆醇苷對缺氧-復氧腎小管上皮細胞損傷保護作用的研究。 目的：探討白藜蘆醇苷(Polydatin，PD)對體外缺氧-復氧HK-2細胞損傷的保護作用。 方法：本實驗HK-2細胞根據(jù)不同處理分為4組：對照組、H/R組、PDTC干預組和PD處理組。對照組HK-2細胞用DMEM常氧培養(yǎng)：H/R組HK-2細胞在缺氧下培養(yǎng)24小時后在常氧(復氧)下繼續(xù)培養(yǎng)24小時：PDTC干預組和PD處理組HK-2細胞均加入PD

8、TC后在缺氧下培養(yǎng)24小時再在常氧(復氧)下培養(yǎng)24小時。于缺氧24小時后復氧6小時分別獲取各組標本，應用MTT法細胞計數(shù)檢測HK-A細胞存活數(shù)，免疫組化法檢測NF-κB p65蛋白表達，RT-PCR法檢測ICAM-1mRNA轉錄，ELISA法檢測ICAM-1蛋白表達情況。 結果:PD處理組各對應時間點HK-2細胞數(shù)量明顯增多于H/R組，有明顯統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。PD處理組NF-κB p65蛋白陽性表達，ICAM-lmR