角蛋白18及其磷酸化在HBV感染慢性肝病及肝細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、角蛋白18（keratin18，K18）是構(gòu)成成熟肝細(xì)胞骨架的主要中間纖維絲蛋白之一，其主要作用是保護(hù)肝細(xì)胞免受各種機(jī)械性和非機(jī)械性的損傷。K18的突變、結(jié)構(gòu)的重組以及磷酸化的改變會(huì)影響肝細(xì)胞的完整性，引起肝細(xì)胞的損傷。此外，K18除了發(fā)揮抗機(jī)械性損傷作用之外還參與著重要的細(xì)胞信號傳導(dǎo)作用，包括Fas/FasL、TRADD等相關(guān)的凋亡通路都與K18及其磷酸化有關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)KI8磷酸化水平在慢性丙型肝炎時(shí)出現(xiàn)增高，并且增高的程度與肝病

2、進(jìn)程呈正相關(guān)。在我國乙型肝炎病毒(HBV)感染是慢性肝病的最常見病因，關(guān)于HBV感染的肝病進(jìn)展與K18及其磷酸化之間關(guān)系的研究在國內(nèi)外未見報(bào)道。因此，研究K18及其磷酸化對揭示HBV感染慢性肝病肝損傷及肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制具有重要意義，對于臨床制定個(gè)體化的治療方案、判定預(yù)后都具有重要的參考價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。
　　 p53是重要的促凋亡基因，p53及其介導(dǎo)的凋亡通路在HBV感染慢性肝病的肝細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要的作用。ASPP2(Ap

3、optosis Stimulating Protein2 ofP53，ASPP2)是p53凋亡刺激蛋白家族的重要成員，能夠與p53結(jié)合選擇性地提高p53的促凋亡活性。我們在前期的工作中應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ASPP2能夠與K18結(jié)合。這一發(fā)現(xiàn)對于揭示K18及其磷酸化與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系和探索其作用方式提供了重要線索。本研究圍繞K18及其磷酸化在HBV感染慢性肝病和肝細(xì)胞凋亡中的作用及其作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　 1、角蛋白1

4、8磷酸化在HBV感染慢性肝病中的作用及其意義
　　 為了研究KI8及其磷酸化在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)病程進(jìn)展中的變化及其意義，我們收集了40例慢性乙肝患者肝穿刺組織，21例肝硬化肝組織（其中靜止性肝硬化11例，活動(dòng)性肝硬化10例）和5例慢性重型肝炎肝組織，以12名健康肝移植供體肝組織作為對照。首先應(yīng)用免疫熒光技術(shù)，分析了不同慢性肝病進(jìn)程當(dāng)中K18及其磷酸化在肝細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

5、K18在正常肝組織中表達(dá)水平較高，呈網(wǎng)狀分布；慢性肝炎中表達(dá)水平無顯著變化；但在肝硬化肝組織和慢性重型肝炎肝組織中，其組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，許多新生膽管細(xì)胞中KI8水平較高；K18 Ser33和Ser52在正常肝組織中磷酸化水平較低，但是隨著肝損傷程度的增加，在新生膽管細(xì)胞中磷酸化水平明顯增高。
　　 應(yīng)用Western Blotting的方法檢測肝組織中K18磷酸化水平，分組分析K18磷酸化水平與慢乙肝病程進(jìn)展的關(guān)系。
　

6、　 (1)將肝組織按照疾病進(jìn)展分為正常組織，慢性肝炎和肝硬化組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，K18 Ser52磷酸化水平在正常肝組織中較低，而慢性肝炎組增高，至肝硬化組織達(dá)到最高水平；K18 Ser33磷酸化水平在慢性肝炎和肝硬化兩組均顯著高于正常組織，但兩組之間無顯著性差異。
　　 (2)進(jìn)一步將40例慢性乙型肝炎患者的肝組織按照Ishak組織學(xué)評分的高低分為3組，即輕度損傷(MiH)組、中度損傷(MeH)組、重度損傷(AdH)組，肝硬化組織

7、按照炎癥程度分為靜止性肝硬化和活動(dòng)性肝硬化，五組之間進(jìn)行比較研究其K18磷酸化水平的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，K18 Ser52磷酸化水平隨著肝病進(jìn)程而逐漸增加，從正常肝組織到活動(dòng)性肝硬化，相鄰兩組之間有顯著性差異。KI8 Set52磷酸化水平變化趨勢是：正常組織

8、化增加明顯(p　　 (3)為了進(jìn)一步探究K18磷酸化與整體肝組織損傷的關(guān)系，我們分析了KI8磷酸化與臨床上最常用的反映肝功能損傷的生化指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)之間的關(guān)

9、系。將本研究中所有慢性乙肝患者的肝組織根據(jù)其ALT水平進(jìn)行分組(1，ALT<40U/L:2，ALT:40～200 U/L:3，ALT>200 U/L)，分別與正常肝組織進(jìn)行比較。結(jié)果顯示KI8 Ser52磷酸化在正常肝組織組、ALT<40U/L組、40～200 U/L組和>200 U/L組中的均值分別為0.73，0.72，1.77和2.71。其中后兩組與前兩組比較均有顯著性差異，而正常組織和ALT<40 U/L組比較無顯著性差異(P=0

10、.976)，表明在HBV感染但肝功能未受損傷的肝組織中K18 Ser52磷酸化水平并不增加。提示K18 Ser52磷酸化水平反映了肝組織的損傷情況，但與HBV感染本身并無直接聯(lián)系。而K18 Ser33位磷酸化水平隨著肝功能水平變化增高明顯，在四組中均值分別為1.02，1.96，2.53和3.00，各組之間存在顯著性差異。值得注意的是，在ALT<40U/L組，K18 Ser33位磷酸化水平也出現(xiàn)增高，與正常相比差異顯著。這一結(jié)果提示我們，

11、K18 Set33位磷酸化可能與HBV感染有關(guān)系。
　　 (4)為了進(jìn)一步研究HBV感染對于K18磷酸化水平的影響，我們選取了HBV感染但是肝功能水平正常的慢性乙肝攜帶者的肝組織標(biāo)本，冰凍切片后分別進(jìn)行了HBsAg抗體和K18兩種磷酸化抗體的雙染免疫熒光檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBsAg在HBV感染的肝細(xì)胞胞漿中表達(dá)，呈現(xiàn)大面積紅染，而在正常對照肝組織中未見染色。K18 Set33磷酸化恰恰在HBV感染的細(xì)胞中出現(xiàn)異常增高，而K18 S

12、er52磷酸化水平仍然較低，與周圍細(xì)胞無差異。
　　 本研究表明：K18磷酸化水平是慢性乙型肝炎肝損傷的重要指標(biāo)；K18 Ser52位磷酸化是慢性乙型肝炎肝病進(jìn)展的判定指標(biāo)；K18 Ser33位磷酸化可能是HBV感染的早期現(xiàn)象，并且是肝組織炎癥損傷程度的判定指標(biāo)。
　　 2、角蛋白18與p53凋亡刺激蛋白2(ASPP2)在肝細(xì)胞凋亡中的作用研究
　　 我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，K18能夠和p53凋亡刺激蛋白(ASPP2

13、)結(jié)合。為進(jìn)一步證實(shí)這種結(jié)合關(guān)系并研究其對于肝細(xì)胞凋亡的意義，我們從三個(gè)方面進(jìn)行了研究。
　　 (1) K18及其磷酸化和ASPP2在肝細(xì)胞凋亡中的作用研究：應(yīng)用免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)，在正常HepG2細(xì)胞中，K18和ASPP2均表達(dá)在細(xì)胞漿中，給予藥物處理的細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，ASPP2進(jìn)入到細(xì)胞核中，發(fā)生核轉(zhuǎn)位。應(yīng)用不同濃度的甲基甲烷磺酸鹽(MMS)作用于HepG2細(xì)胞，用Annexin V/PI染色流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡水平，研究K

14、18及其磷酸化和ASPP2在肝細(xì)胞凋亡不同狀態(tài)下的水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，K18總體水平隨著藥物濃度增加而降低，ASPP2和K18 Ser52位磷酸化水平隨著藥物濃度增加而增加，KI8 Ser33磷酸化在低濃度藥物作用下水平增高，但在高濃度藥物作用下反而降低。以上結(jié)果說明，ASPP2在肝細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)出現(xiàn)核轉(zhuǎn)位，從而進(jìn)入到細(xì)胞核中參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，而K18的Ser33或Ser52磷酸化水平的變化與肝細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。
　

15、　 (2)ASPP2與K18結(jié)合功能區(qū)域的確定：采用重組的GST-mASPP2，ASPP2N-末端和C-末端融合蛋白分別與K18融合蛋白進(jìn)行免疫共沉淀。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ASPP2的N-末端能夠與KI8結(jié)合。進(jìn)一步將ASPP2的N-末端逐步截短，表達(dá)了ASPP2 N-末端的截短小片段融合蛋白，再次與K18進(jìn)行體外免疫沉淀反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)．ASPP2的N-末端位于83-105個(gè)氨基酸殘基之間正是與K18結(jié)合的關(guān)鍵部位，而其下游的氨基酸殘基則與結(jié)

16、合能力有關(guān)系。應(yīng)用293T細(xì)胞分別高效轉(zhuǎn)染K18-pcDNA4或K18S33A、K18S52A，提取細(xì)胞總蛋白應(yīng)用GST-mASPP2融合蛋白進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASPP2能夠與KI8結(jié)合，但在轉(zhuǎn)染突變K18的細(xì)胞中結(jié)合降低，在轉(zhuǎn)染S33A突變K18的細(xì)胞中結(jié)合最少。提示這種結(jié)合可能與33位的絲氨酸磷酸化有關(guān)系。為了研究這種結(jié)合與肝病進(jìn)展的關(guān)系，我們提取了活動(dòng)性肝硬化和靜止性肝硬化肝組織的總蛋白，利用免疫共沉淀技術(shù)分析了KI8和

17、ASPP2的結(jié)合水平與肝病進(jìn)展的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ASPP2在靜止性肝硬化中與K18的結(jié)合更強(qiáng)，在活動(dòng)性肝硬化結(jié)合顯著減少。說明，在肝組織受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，ASPP2與K18的結(jié)合減少。
　　 (3) K18與ASPP2結(jié)合作用方式的初步研究：將細(xì)胞共轉(zhuǎn)染ASPP2和K18或S33A，S52A定點(diǎn)突變的K18，給予細(xì)胞藥物刺激，轉(zhuǎn)染S33A K18的細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，ASPP2全部進(jìn)入到細(xì)胞核中，而轉(zhuǎn)染KI8和S52A K18的細(xì)胞發(fā)

18、生凋亡時(shí)，ASPP2部分進(jìn)入到核中，大部分仍然位于細(xì)胞漿中，說明K18Set33位磷酸化與ASPP2的核轉(zhuǎn)位有關(guān)。應(yīng)用報(bào)告基因分析法研究K18對ASPP2-p53及其調(diào)控的下游分子Bax轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ASPP2的存在能夠顯著提高p53刺激的Bax-luc報(bào)告基因活性，當(dāng)加入過量野生型K18后，Bax-luc報(bào)告基因活性大大減低，提示K18可能參與了抑制ASPP2的促p53轉(zhuǎn)錄激活作用；當(dāng)用K18S33A質(zhì)粒替代KI8后，Ba

19、x-luc報(bào)告基因活性水平與ASPP2單獨(dú)存在時(shí)大致相同。這一結(jié)果再次提示K18 Ser33位磷酸化能夠促進(jìn)K18與ASPP2的結(jié)合，從而間接抑制ASPP2與p53的結(jié)合而發(fā)揮凋亡抑制作用。
　　 上述實(shí)驗(yàn)研究表明：K18磷酸化在肝細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用；正常情況下KI8在細(xì)胞漿中以Ser33位磷酸化依賴的方式結(jié)合ASPP2，在細(xì)胞遇到輕度損傷性刺激時(shí)，K18 Ser33和Ser52位磷酸化水平均出現(xiàn)增高，使得ASPP2與K