內(nèi)皮祖細(xì)胞生嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血中表達(dá)及預(yù)后的意義.pdf

1、背景：EPCs(endothelial progenitor cells)來(lái)源于胚胎的中胚層和出生后的骨髓，不僅參與胚胎血管生成，而且近年研究發(fā)現(xiàn)，EPC也參與出生后的血管新生過(guò)程，是一群被發(fā)現(xiàn)存在于胎肝、臍帶血和成人外周循環(huán)血中的、能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞的多潛能細(xì)胞，這群細(xì)胞不但具有修復(fù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的功能而且還能增強(qiáng)組織缺血后的血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)，提示在缺血性疾病、防止血管再狹窄

2、、血管創(chuàng)傷愈合等過(guò)程中具有重要的治療作用。最近的研究顯示：EPCs可促進(jìn)顱腦創(chuàng)傷大鼠損傷區(qū)腦組織的血管、神經(jīng)新生以及神經(jīng)功能恢復(fù)，這為下一步的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 1.研究創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、增殖及鑒定。
　　 2.探討循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷患者血管損傷修復(fù)的可能機(jī)制。
　　 3.探討顱腦損傷對(duì)循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員及預(yù)后判斷的意義。
　　 方

3、法：
　　 1.應(yīng)用密度梯度離心法分離創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用EGM培養(yǎng)基，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3天換液去除未貼壁細(xì)胞，以后每3天換液一次，倒置相差熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)變化特征。通過(guò)硫氰酸熒光素標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)攝取試驗(yàn)和荊豆凝集素(FITC-UEA-1)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能鑒定。體外培養(yǎng)至第7天，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34，CD133雙熒光

4、標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞所占比率。
　　 2.連續(xù)收集2009年1月至2010年4月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科治療的重型創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)而無(wú)肢體損傷患者外周血及血清標(biāo)本。創(chuàng)傷性顱腦損傷患者損傷程度由Glasgow Coma Scale(GCS)評(píng)分決定。同期收集18-60歲健康志愿者外周血及血清標(biāo)本。嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷患者及對(duì)照組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量分別在腦損傷后的1天、4天、7天、14天及21天用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在相同時(shí)間點(diǎn)對(duì)上述

5、兩組血清的血管生成素(Ang-1)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。
　　 3.收集嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷患者21例及20例正常對(duì)照組的外周血及血清標(biāo)本。分別于創(chuàng)傷性腦損傷后的1天、4天、7天、14天及21天用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量及用ELISA檢測(cè)血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)變化。并對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷患者傷后6個(gè)月的glasgow outcome scale(GOS)評(píng)

6、分進(jìn)行前瞻性的分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.培養(yǎng)3天換液去除未貼壁細(xì)胞后，可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞呈集落式生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多為短梭型或多角形。培養(yǎng)7天，梭型細(xì)胞較前增多，形成細(xì)胞團(tuán)。14天可見(jiàn)到細(xì)胞形成索狀或網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu)。倒置相差熒光顯微鏡下觀察顯示胞質(zhì)和胞膜呈綠色和紅色雙熒光，說(shuō)明內(nèi)皮祖細(xì)胞能特異性吸附DiI-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-1，具有內(nèi)皮細(xì)胞功能。流式細(xì)胞儀鑒定EPC細(xì)胞表型CD34和CD133雙陽(yáng)性的細(xì)胞為1

7、8.57％。
　　 2.與對(duì)照組相比，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞在嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷后第4天降低，第7天達(dá)到最高。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平始終高于對(duì)照組水平。血管生成素1在第14天到達(dá)最高峰。循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞與嚴(yán)重腦創(chuàng)傷后7天、14天的Ang-1和VEGF血清水平明顯相關(guān)。
　　 3.與對(duì)照組相比，循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化與前期研究一致。顱腦創(chuàng)傷后第7天達(dá)到高峰，并且與患者傷后6個(gè)月的GOS評(píng)分明顯相關(guān)。MMP-9和VEGF水平傷后始終高于對(duì)照

8、組。循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞與創(chuàng)傷性腦損傷后1天的GCS評(píng)分相關(guān)，與創(chuàng)傷性腦損傷后7天、14天的MMP-9和VEGF水平相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.創(chuàng)傷性腦損傷患者外周血來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞在體外應(yīng)用EGM培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，為內(nèi)皮祖細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.血管生成素-1(Angiopoietin-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是調(diào)節(jié)血管生成反應(yīng)和維持血管完整性的兩個(gè)關(guān)鍵性蛋白，在患者腦創(chuàng)傷后14

9、天達(dá)到峰值，并且在腦創(chuàng)傷后7天、14天分別與內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)，這些結(jié)果提示嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血管生成素-1及循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞有可能參與到了血管修復(fù)的病理生理過(guò)程中。
　　 3.我們的研究結(jié)果顯示創(chuàng)傷性腦損傷后循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞升高，MMP-9和VEGF可能參與調(diào)節(jié)嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷后內(nèi)皮祖細(xì)胞由骨髓動(dòng)員至外周血的過(guò)程當(dāng)中。我們的研究結(jié)果還顯示循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞與患者的神經(jīng)功能恢復(fù)相關(guān)聯(lián)，這些證據(jù)提示循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞是判斷血管新