TREK1通道阻滯劑篩選及其抗抑郁機(jī)制的探討.pdf

1、目的:
　　當(dāng)前的抗抑郁藥低有效率低已成為抑郁癥治療最突出的臨床難題之一。近年來(lái)基因工程鼠研究表明TREK1亞型雙孔鉀離子通道(TWIK-related mechanogated two pore K+ channel)是抗抑郁治療的靶點(diǎn)，阻斷該通道與提高抗抑郁劑療效相關(guān)。而藥物基因組學(xué)研究也表明TREK1基因多態(tài)性與抗抑郁劑耐藥有關(guān)。然而目前尚缺乏理想的TREK1通道阻斷劑，阻斷TREK1通道發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機(jī)制也知之甚少。因此

2、本課題擬篩選高效TREK1阻滯劑，評(píng)估其抗抑郁療效，并進(jìn)一步探討阻斷TREK1通道發(fā)揮抗抑郁樣作用的機(jī)制。
　　方法:
　　1.通過(guò)分子克隆技術(shù)構(gòu)建TREK1鉀通道重組質(zhì)粒TREK1-pCDNA3.1(+)/pEGFP-N1，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞(Human embryonic kidney，HEK293)，實(shí)現(xiàn)TREK1通道蛋白體外表達(dá)。2.利用鉈離子熒光高通量篩選法篩查中國(guó)科學(xué)院上海藥物所國(guó)家化合物庫(kù)，篩選可能阻

3、斷TREK1通道的化合物;利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢驗(yàn)篩選化合物對(duì)TREK1鉀通道的敏感性、特異性。3.利用表面等離子體共振(Surface plasmonresonance，SPR)技術(shù)測(cè)定篩選化合物與TREK1和五羥色胺1A受體(5-hydroxytryptaminereceptor1A，5-HTR1A)親和力。4.通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)確定篩選化合物干預(yù)動(dòng)物模型的有效劑量。5.通過(guò)慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激(Chronic unpredicta

4、ble mild stress，CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法建立抑郁癥動(dòng)物模型，給予篩選的TREK1阻斷劑、文獻(xiàn)報(bào)道的TREK1阻斷劑spadin和抗抑郁劑西酞普蘭進(jìn)行干預(yù)，利用強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(Forced swimming test，F(xiàn)ST)、開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open field test，OFT)及蔗糖水偏好實(shí)驗(yàn)(Sucrose preference test，SPT)評(píng)估篩選化合物的抗抑郁療效。6.通過(guò)場(chǎng)電位電生理實(shí)驗(yàn)測(cè)量阻斷TREK1后抑郁模型

5、大鼠中縫核(Dorsal raphie nuclei，DRN)5-HT能神經(jīng)元、前額葉(Prefrontal cortex，PFC)錐體神經(jīng)元場(chǎng)電位的變化。7.利用免疫印跡及real-time PCR方法檢測(cè)阻斷TREK1通道后2周及4周抑郁模型大鼠DRN、PFC及海馬CA1/CA3區(qū)蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding prote

6、in，CREB)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)表達(dá)變化。8.利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)5-HTR1A激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)表達(dá)在HEK293細(xì)胞膜上TREK1通道鉀電流的影響;在原代培養(yǎng)的孕17天胎鼠海馬神經(jīng)元中分別應(yīng)用篩選的TREK1阻斷劑和文獻(xiàn)報(bào)道的TREK1阻斷劑spadin，并同時(shí)給予5-HTR1A激動(dòng)劑和拮抗劑干預(yù)24h，通過(guò)免疫印跡法觀察5-HTR1A功能對(duì)神經(jīng)元

7、PKA、CREB和BDNF信號(hào)分子表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.高通量篩選的化合物SID1900抑制TREK1通道熒光強(qiáng)度的IC50值為28.72±3.67μM，該化合物在0mV下阻斷TREK1通道鉀電流的IC50值為29.72±2.4μM，且對(duì)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元雙孔鉀離子通道(Two pore K+ channel，K2P)具有特異性阻斷作用(p＜0.001，IC50=87.09±4.2μM)，對(duì)Na+、Ca2+和混

8、合K+離子通道無(wú)顯著影響(P＞0.05）。2.SPR動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示:不同濃度SID1900與TREK1鉀離子通道均具有較高親和力，平衡解離常數(shù)(KD)為1.905×10-10 M。3.藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)表明:SID1900可通透大鼠血腦屏障(通透率78.74％)且生物利用度良好(78.03±9.65％)，有效干預(yù)劑量為14.33μM/kg。4.與CUMS應(yīng)激抑郁模型組相比，SID1900干預(yù)2周可顯著減少大鼠FST不動(dòng)時(shí)間(p＜0.001)

9、。療效早于西酞普蘭一周;另外在改善大鼠OFT水平活動(dòng)、垂直活動(dòng)評(píng)分及恢復(fù)蔗糖水偏好性方面，SID1900也顯著優(yōu)于西酞普蘭(p=0.001，p＜0.001，p=0.031)，與spadin一致。5.場(chǎng)電位電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:用SID1900(14.33μM/kg，i.p.)干預(yù)4周后，應(yīng)激抑郁大鼠DRN區(qū)5-HT能神經(jīng)元和PFC區(qū)錐體神經(jīng)元電沖動(dòng)發(fā)放率(Firing rate)分別為:(4.35±0.61)Hz和(5.02±0.82)H

10、z，與模型組相比顯著增加(P=0.014，p=0.003)，明顯高于西酞普蘭(p＜0.05），與spadin干預(yù)結(jié)果一致。另外SID1900、spadin和西酞普蘭分別于給藥6min、7min40s和9min40s后顯著增加CUMS模型大鼠DRN區(qū)5-HT能神經(jīng)元firing rate。6.real-time PCR和免疫印跡檢測(cè)結(jié)果表明:SID1900干預(yù)CUMS模型大鼠2周可顯著上調(diào)中縫核、海馬CA1/CA3和PFC區(qū)PKA、CRE

11、B和BDNF mRNA及BDNF蛋白表達(dá)(與模型組相比p＜0.001)，這與spadin干預(yù)2周和西酞普蘭干預(yù)4周的結(jié)果接近。7.在0mV下30μM5-HTR1A激動(dòng)劑8-OH-DPAT可增強(qiáng)19.14±1.34％ TREK1通道鉀電流，而10μM5-HTR1A拮抗劑WAY100635可阻斷17.18±1.26％ TREK1鉀電流:在原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中同時(shí)應(yīng)用8-OH-DPAT和SID1900較單獨(dú)應(yīng)用SID1900對(duì)上調(diào)PKA-C

12、REB-BDNF表達(dá)效果更顯著(p＜0.05)，而同時(shí)給予WAY100635和SID1900與單獨(dú)應(yīng)用SID1900相比，PKA-CREB-BDNF表達(dá)顯著降低(p＜0.05)。另外，SPR數(shù)據(jù)顯示:不同濃度SID1900與5-HT1A受體均具有較低親和力，平衡解離常數(shù)(KD)為2.597×10-4M。
　　結(jié)論：
　　1.本研究篩選的化合物SID1900可有效阻斷TREK1通道，對(duì)雙孔鉀離子通道具有較高特異性;2.SID1