灰葡萄孢菌菌株CanBc-1生物學特性及其致病力衰退機制研究.pdf

1、本文研究了灰葡萄孢菌弱毒菌株CanBc-1的生物學特性、致病力衰退相關(guān)RNA病毒(Botrytis cinerea debilitation related RNA virus,簡稱BcDRV)的基因組結(jié)構(gòu)及其分類屬性、致病力衰退的分子機理。最后還以弱毒將菌株CanBc-1及其恢復(fù)致病力的單分生孢子后代CanBc-1c-66為材料,初步分析了菌株CanBc-1中差異表達的基因。取得了如下研究結(jié)果:
　　 首先,對源于6個地區(qū)和1

2、4種寄主植物的23個灰葡萄孢菌菌株進行了生物學特性分析。鑒定出一個異常菌株CanBc-1,其生長緩慢、菌絲異常分枝、僅產(chǎn)生少量分生孢子和菌核、完全喪失了致病能力。在菌株CanBc-1菌絲中檢測到一種3.0 kb大小的dsRNA分子。通過對菌株CanBc-1單分生孢子后代的致病力,發(fā)現(xiàn)該菌株單分生孢子后代的致病力發(fā)生分化,有強毒后代出現(xiàn)。通過對不同類型殺菌劑的抗性測定,發(fā)現(xiàn)弱毒菌株CanBc-1對多菌靈、菌核凈、農(nóng)利靈等具有抗性。

3、　　 其次,對灰葡萄孢菌弱毒菌株CanBc-1中的致病力衰退相關(guān)RNA病毒(Botrytiscinerea-debilitation related RNA virus,縮寫為BcDRV)基因組的分子生物學特性進行了研究。通過cDNA克隆和RT-PCR技術(shù)獲得了BcDRV基因組的全長序列,共2806 bp,GC含量為33.3％。通過與網(wǎng)上已知序列的分析比對,確定CanBc-1中的dsRNA分子是一個線粒體病毒,屬于裸露病毒科(Narn

4、aviridae)、線粒體病毒屬(Mitovirus)。此外,還對灰葡萄孢菌菌絲的超微結(jié)構(gòu)進行了透射電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)弱毒菌株CanBc-1菌絲線粒體出現(xiàn)異常,包括皺縮、潰解、內(nèi)部沒有瘠等特征?？梢?BcDRV可能以灰葡萄孢菌的線粒體作為攻擊目標。
　　 再次,對灰葡萄孢菌弱毒菌株CanBc-1的致病力衰退機制進行了研究。通過對不同灰葡萄孢菌菌株的侵染結(jié)構(gòu)、果膠酶、植物毒素次生代謝產(chǎn)物、酸類物質(zhì)和漆酶等致病相關(guān)因子的研究,發(fā)現(xiàn)弱毒菌

5、株CanBc-1能夠正常的分泌果膠酶、漆酶和植物性毒素物質(zhì),RT-PCR結(jié)果也證實弱毒菌株CanBc-1的果膠酶基因(Bcpg1-6)、漆酶基因(Bclcc1,Bclcc2)和毒素合成相關(guān)基因(Bcbot1)均能正常表達；但是通過對侵染結(jié)構(gòu)的觀察,發(fā)現(xiàn)弱毒菌株CanBc-1的菌絲頂端不能正常的形成侵染結(jié)構(gòu)。因此,導(dǎo)致弱毒菌株CanBc-1致病力衰退機理包括:菌絲線粒體發(fā)生畸變,菌絲頂端不能正常產(chǎn)生侵染墊結(jié)構(gòu)。
　　 最后,對弱毒

6、菌株CanBc-1和強毒菌株CanBc-1c-66(可視為菌株CanBc-1的近等基因系)在轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達基因進行了分析。采用基因表達譜分析的方法,共得到了2288個差異表達的基因。在弱毒菌株CanBc-1中,1392個基因上調(diào)表達,896個基因下調(diào)表達。根據(jù)KEGG基因功能分類,表明差異表達的基因的功能涉及到糖類代謝(8％)、脂質(zhì)代謝(5％)、核苷代謝(2％)、氨基酸代謝(4％)、多糖的生物合成與代謝(1％)、輔助因子和維生素代

7、謝(2％)、能量代謝(3％)、聚酮化合物和萜類化合物的生物合成(1％)、外源物質(zhì)的生物降解(1％)、酶類家族(10％)、轉(zhuǎn)錄(2％)、翻譯(2％)、聚集和降解(2％)、復(fù)制和修復(fù)(2％)、膜運輸(5％)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(1％)、配體受體的相互作用(3％)、細胞內(nèi)加工處理(3％)和未分類蛋白(43％)等19類。其中,可能與灰葡萄孢菌和其它病原菌致病過程相關(guān)的差異表達基因有12個。上述結(jié)果為進一步挖掘灰葡萄孢菌致病相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。