石杉?jí)A甲酶標(biāo)納米金探針檢測(cè)方法的研究.pdf

1、石杉?jí)A甲(HupA)是一種高效且可逆的乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑，是目前治療老年癡呆癥（又稱阿爾茨海默病，AD）最有前景的藥物。隨著世界人口老齡化的加快，阿爾茨海默病患者逐年增加，國(guó)內(nèi)外對(duì)其需求量日益增加。當(dāng)前醫(yī)學(xué)界尚沒有發(fā)現(xiàn)合適的HupA替代品，人工合成法也局限于實(shí)驗(yàn)室使用，目前HupA主要從石杉屬和馬尾杉屬等植物中提取獲得，然而該類植物野生資源匱乏，且HupA含量甚微。因此建立高靈敏度的HupA檢測(cè)方法，對(duì)充分利用該類資源具有十

2、分重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　近年來，納米技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是納米金標(biāo)記技術(shù)備受業(yè)界關(guān)注。該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確及無毒等優(yōu)點(diǎn)，為藥物的分析測(cè)定提供一種新的研究思路。納米金的表面積大、生物兼容性好，其表面能夠通過靜電作用與抗體、酶等生物大分子相結(jié)合，還可以與巰基或PolyA修飾的DNA相結(jié)合，形成探針后后生物分子的活性基本不受影響，且性質(zhì)較為穩(wěn)定，這些功能化的納米金探針用于免疫分析中，可顯著提高方法的檢測(cè)靈敏度。免疫磁珠（磁珠探針）是

3、近年來新興的一種功能材料，指偶聯(lián)了抗原或抗體的磁性微球。磁珠具有較強(qiáng)的磁響應(yīng)性，通過引入磁場(chǎng)，可以實(shí)現(xiàn)快速分離、富集目標(biāo)物，具有操作簡(jiǎn)便、快速高效和不影響生物活性等優(yōu)點(diǎn)，在免疫分析領(lǐng)域、細(xì)胞分離等方面具有獨(dú)特的優(yōu)越性。
　　本論文利用納米金探針和磁珠探針的特性，以競(jìng)爭(zhēng)免疫分析為基礎(chǔ)，研發(fā)了檢測(cè)HupA的新型酶標(biāo)免疫分析方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的含量測(cè)定，為藥物中有效成分的微量測(cè)定提供新的分析策略。論文共分為三章，主要內(nèi)容如下:

4、>　　第一章:酶標(biāo)納米金探針檢測(cè)石杉?jí)A甲的方法研究。
　　采用檸檬酸三鈉還原法合成納米金，將酶和抗體修飾于納米金顆粒表面制備納米金探針，并對(duì)探針制備條件進(jìn)行優(yōu)化，如標(biāo)記pH、最適抗體標(biāo)記量、酶和抗體標(biāo)記比例等，采用紫外分光光度法和透射電鏡對(duì)制備好的納米金探針進(jìn)行表征。將制備好的納米金探針引入到免疫分析中，采用競(jìng)爭(zhēng)免疫分析模式，建立了一種檢測(cè)HupA的新方法。并對(duì)實(shí)驗(yàn)條件如包被抗原和納米金探針稀釋比例、最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，在

5、最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該方法測(cè)定HupA的線性范圍為0.5～150ng/mL，線性方程為I=0.2985 lgC+0.1704(r=0.9960)，檢測(cè)限為602.56 pg/mL。將該法應(yīng)用于蛇足石杉中HupA含量測(cè)定，經(jīng)國(guó)標(biāo)法驗(yàn)證，二者測(cè)定結(jié)果基本一致，回收率在97.08～106.11％之間，結(jié)果較好。該法檢測(cè)時(shí)間短，靈敏度高且重復(fù)性好，是一種簡(jiǎn)便、高效、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)體系，有利于推廣應(yīng)用。
　　第二章:磁珠和酶標(biāo)納米金探針檢測(cè)石杉?jí)A甲

6、的方法研究。
　　本研究引入磁性載體-磁珠，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的96孔酶標(biāo)板，將石杉?jí)A甲完全抗原(HupA-OVA)標(biāo)記在磁珠上?；诖判苑蛛x，利用納米金探針，建立了快速、高效、靈敏度高的檢測(cè)石杉?jí)A甲的酶標(biāo)免疫新方法。考察并優(yōu)化了磁珠探針和納米金探針的稀釋比例、最佳競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間等免疫分析條件，最終確立了檢測(cè)體系，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，該方法在HupA濃度為0.075～180ng/mL之間，抑制率與HupA濃度的對(duì)數(shù)值lgC呈良好的線性關(guān)系，線性

7、方程為I=0.2813 lgC+0.3051(r=0.9950)，檢測(cè)限為160.32 pg/mL。將該法應(yīng)用于石杉?jí)A甲片劑含量測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法所測(cè)結(jié)果基本一致，該方法的靈敏度較前一種方法更高、線性范圍更寬且縮短了檢測(cè)時(shí)間。
　　第三章:磁珠和DNA-納米金探針檢測(cè)石杉?jí)A甲的方法研究。
　　在前兩種方法研究的基礎(chǔ)上，基于磁珠建立了DNA-納米金探針檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的精密度、重復(fù)性、專屬性等進(jìn)行了考察，結(jié)果均在允許范