水稻白葉枯菌OS198中兩個(gè)tal基因的克隆及功能分析.pdf

1、水稻白葉枯病是水稻上最重要的細(xì)菌病害之一，它是由稻黃單胞桿菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）引起的。在Xoo中轉(zhuǎn)錄激活類似效應(yīng)蛋白（Transcription activator-like effectors，TALEs）是通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)分泌到寄主水稻中的一類泌出蛋白，其編碼基因?yàn)閠al基因。在Xoo中，tal基因的研究主要集中于已經(jīng)測(cè)序的幾個(gè)菲律賓、日本和韓國(guó)菌株上，中國(guó)菌

2、株上報(bào)道的有avr/pthC8a，它為C8菌株中的一個(gè)無(wú)毒基因。挖掘新的tal基因、解析其功能是揭示病原細(xì)菌致病分子機(jī)制的基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步進(jìn)行水稻抗白葉枯病的遺傳工程提供理論依據(jù)和基因資源。
　　OS198是水稻白葉枯菌中國(guó)系統(tǒng)6號(hào)小種的代表菌株。它在多個(gè)水稻品種上（包括國(guó)際水稻所的近等基因系上）都表現(xiàn)為弱毒力。為了解該菌株的致病性分子遺傳機(jī)制，我們對(duì)OS198基因文庫(kù)克隆pUF369和pUF377中，經(jīng)SphⅠ酶切后大小分別為3

3、.2 kb和2.6kb的tal基因進(jìn)行了克隆和生物學(xué)功能分析。
　　凝膠回收pUF369中3.2 kb的SphⅠ酶切片段和pUF377中2.6kb的SphⅠ酶切片段，將其分別克隆到tal基因的克隆骨架載體pZW上，獲得含完整tal基因克隆pzw369-3.2、pzw377-2.6，將其線性化后連接到黃單胞菌表達(dá)載體pHM1上，獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pHZ369、pHZ377。
　　采用Tn5離體插入pzw369-3.2和p

4、zw377-2.6，篩選tal基因被插入突變的克隆，利用Tn5末端的兩個(gè)反向引物對(duì)突變體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序序列拼接后獲得tal基因的完整序列。pzw369-3.2中tal基因序列拼接后命名為talR26.5(NCBI登錄號(hào)為KJ192237.1)。 talR26.5基因全長(zhǎng)4452 bp，編碼1483個(gè)氨基酸。兩個(gè)BamHI位點(diǎn)之間序列大小為4281 bp。 Blast分析發(fā)現(xiàn)，TALR26.5與菲律賓菌株P(guān)XO357中的AvrXa7-3M

5、和日本菌株MAFF311018中的YP451895蛋白在氨基酸序列上具有99％的一致性，34個(gè)氨基酸重復(fù)區(qū)域相同，在C端和N端有5個(gè)氨基酸的差異。pzw377-2.6序列拼接后命名為talR20.5(NCBI登錄號(hào)為KJ192238)，talR20.5基因全長(zhǎng)3819bp，編碼1272個(gè)氨基酸，兩個(gè)BamHI位點(diǎn)之間序列大小為3648 bp。Blast分析發(fā)現(xiàn)，TALR20.5與日本菌株MAFF311018中的YP451156蛋白具有9

6、8％的一致性，它們N端氨基酸序列相同，在第1，8，9，20重復(fù)區(qū)域共有9個(gè)氨基酸的差異，C末端有11位氨基酸的差異，且有三個(gè)重復(fù)區(qū)的RVD不一樣，所以talR20.5是一個(gè)新的tal基因。
　　將pHZ369、pHZ377分別導(dǎo)入PXO99A菌株中，測(cè)定了重組菌PXO99A/pHZ369和PXO99A/pHZ377在26個(gè)品種苗期水稻上的致病力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PXO99A相比，PXO99A/pHZ369在23個(gè)品種的水稻上致病力都沒(méi)

7、有差異，而在IRBB8、IRBB14和IRBB214三個(gè)品種水稻上致病力顯著降低;PXO99A/pHZ377在水稻IRBB50上的致病力和水稻葉片中的生長(zhǎng)能力顯著下降。但與OS198相比，無(wú)論是病斑長(zhǎng)度，還是病原菌的數(shù)量，PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377處理都顯著高于OS198。運(yùn)用半定量RT-PCR分析接種PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377后水稻感病基因Os8N3的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，注射接種24

8、h后，PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377對(duì)水稻感病基因Os8N3的誘導(dǎo)表達(dá)與PXO99A相比降低。
　　在非寄主植物本氏煙上接種，發(fā)現(xiàn)OS198引起HR面積大且癥狀明顯，PXO99A/pHZ369、PXO99A/pHZ377激發(fā)HR的能力比PXO99A明顯增強(qiáng)，對(duì)接種葉片進(jìn)行trypan blue染色觀察接種部位，發(fā)現(xiàn)與PXO99A相比，PXO99A/pHZ369誘導(dǎo)煙草葉片細(xì)胞死亡數(shù)明顯增多。
　　以上