調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)在放射性肺纖維化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、胸部放療是治療肺癌、食道癌、乳腺癌以及多種淋巴瘤等的常用方法之一。然而由于肺組織對(duì)電離輻射具有中度敏感性，胸部放療后容易引起放射性肺炎及肺纖維化。放射性肺炎出現(xiàn)于胸部照射后早期（3個(gè)月內(nèi)），臨床癥狀為低度發(fā)燒，中度咳嗽等;隨著肺炎的進(jìn)展，可于照射后晚期（6個(gè)月后）出現(xiàn)肺纖維化的癥狀，主要特征為成纖維細(xì)胞過度增生，膠原和細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，臨床表現(xiàn)為慢性呼吸衰竭等不可逆的癥狀，最終導(dǎo)致患者死亡。由于放射性肺纖維化的發(fā)病率較高、預(yù)測(cè)性低、治

2、療困難，且死亡率高于原發(fā)癌癥，嚴(yán)重影響了放療的臨床應(yīng)用。因此放射性肺纖維化的治療已成為放射醫(yī)學(xué)臨床及基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究將為預(yù)防或緩解放射性肺纖維化提供重要理論依據(jù)。
　　前期研究表明，放射性肺纖維化發(fā)生過程中肺內(nèi)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)增多，導(dǎo)致免疫平衡向Treg偏移。Treg是CD4+T細(xì)胞的亞群，具有免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)于維持機(jī)體免疫耐受和內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有至關(guān)重要的作用。與

3、其他T淋巴細(xì)胞相比，Treg對(duì)電離輻射具有較高耐受性。而已有文獻(xiàn)報(bào)道Treg參與多種纖維增生性疾病的發(fā)病，因此本工作對(duì)Treg在放射性肺纖維化中的作用進(jìn)行研究，為其治療提供新的線索。
　　成纖維細(xì)胞是肺纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，其分泌產(chǎn)生的膠原過度沉積是纖維化發(fā)生的主要原因。現(xiàn)有研究表明，在病理狀態(tài)下，除原發(fā)灶增殖外，骨髓來源的循環(huán)纖維細(xì)胞（circulating fibrocyte）的分化及肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithe

4、liamesenchymal transitions，EMT)也是成纖維細(xì)胞的重要來源，參與了多種纖維增生性疾病的發(fā)病。Fibrocyte是骨髓來源的前體細(xì)胞，具有分泌膠原、參與抗原提呈等重要功能。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelia mesenchymal transitions，EMT）主要包括上皮細(xì)胞極性丟失、細(xì)胞骨架重排、間質(zhì)細(xì)胞特征獲得等重要的生物學(xué)過程。有研究表明，循環(huán)纖維細(xì)胞分化及上皮細(xì)胞EMT受多種免疫因子的調(diào)控，并與免疫平

5、衡狀態(tài)相關(guān)。而Treg是維持免疫平衡的重要因素，對(duì)循環(huán)纖維細(xì)胞分化及上皮細(xì)胞EMT具有潛在的調(diào)節(jié)作用。因此本課題旨在研究Treg在放射性肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律，闡明其對(duì)放射性肺纖維化的作用以及可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，為防治或緩解放射性肺纖維化提供有效靶點(diǎn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。工作主要內(nèi)容如下：
　　1.建立小鼠放射性肺纖維化模型。以C57BL/6小鼠為受試對(duì)象，采用20Gy60Coγ射線對(duì)小鼠進(jìn)行單次全胸部照射。結(jié)果顯示，小鼠接受全胸部照

6、射后，體重增長(zhǎng)變緩，外周血白細(xì)胞驟減。肺組織HE染色結(jié)果顯示，照射后2周內(nèi)，小鼠肺泡腔中出現(xiàn)滲出液，支氣管上皮細(xì)胞脫落;照射后1個(gè)月到6個(gè)月，肺泡結(jié)構(gòu)改變，肺泡融合及肺泡萎陷的現(xiàn)象增多，隨時(shí)間延長(zhǎng)纖維化癥狀逐漸加重。Masson三色染色結(jié)果顯示，照射后1個(gè)月到6個(gè)月，小鼠肺間質(zhì)中纖維增生，膠原沉積，與總膠原含量測(cè)定結(jié)果相符。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，在照射后1周內(nèi)，外周血中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例減少，在第14天時(shí)短暫升高后恢復(fù)正常

7、水平，而肺組織中Treg從第14天到6個(gè)月內(nèi)持續(xù)升高。
　　2.建立Treg抑制模型，觀察Treg抑制對(duì)放射性肺纖維化的作用。采用腹腔注射抗CD25抗體抑制小鼠Treg增高。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，胸部照射小鼠注射抗CD25抗體后外周血及肺內(nèi)Treg的增高受到抑制，照后14d起肺內(nèi)Treg比例與未照射組小鼠相當(dāng)。肺組織病理切片HE染色結(jié)果顯示，Treg被抑制后，受照小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞減少，肺泡融合現(xiàn)象減弱，Masson三色染色顯

8、示肺間質(zhì)膠原分布減少，表明肺纖維化的癥狀減輕。以上結(jié)果表明，抑制Treg可減緩肺纖維化的發(fā)生，提示Treg參與促進(jìn)放射性肺纖維化的發(fā)病。
　　3.Treg通過影響CD4+T細(xì)胞，以及Th1/Th2細(xì)胞因子之間的平衡參與放射性肺纖維化的發(fā)病。小鼠胸部照射后，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，肺內(nèi)CD4+T和Th17的細(xì)胞比例和數(shù)量在纖維化階段增加;當(dāng)Treg被抑制后，兩種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步升高。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠受照后，肺組織中的Th1

9、型細(xì)胞因子（IFN-γ、 IL-12、IL-2、IL-1α）和Th2型細(xì)胞因子（IL-10、IL-6、IL-4和IL-5）含量在纖維化階段均高于未照射組;當(dāng)Treg被抑制后，小鼠肺組織中Th1型細(xì)胞因子含量升高，Th2型細(xì)胞因子含量降低，細(xì)胞因子向Th1型極化。以上結(jié)果表明，Treg可能夠通過抑制Th17分化，擾亂Th1/Th2細(xì)胞因子之間的平衡，促進(jìn)放射性肺纖維化形成。
　　4.Treg調(diào)節(jié)循環(huán)纖維細(xì)胞分化參與放射性肺纖維化中的

10、發(fā)病。動(dòng)物模型顯示，小鼠受照后肺組織中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)增加與肺纖維化增生一致，與Treg的變化趨勢(shì)吻合;當(dāng)Treg被抑制后，小鼠肺組織中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)明顯降低。趨化因子檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠受照后，肺組織中的趨化因子CCL2和CCL3含量明顯升高，與循環(huán)纖維細(xì)胞變化趨勢(shì)一致;當(dāng)Treg被抑制后，小鼠肺組織中CCL2及CCL3含量降低，但仍高于未照射組。以上結(jié)果表明，Treg可能通過促進(jìn)循環(huán)纖維細(xì)胞在肺部的聚集而加速放射性肺纖維化，而循環(huán)纖

11、維細(xì)胞聚集由趨化因子CCL2及CCL3介導(dǎo)。采用分離的小鼠脾臟Treg和單個(gè)核細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)14天后，Treg與單個(gè)核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中纖維細(xì)胞的比例增高，并與Treg比例具有劑量效應(yīng)關(guān)系，表明Treg能促進(jìn)循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)細(xì)胞上清中CCL2和CCL3趨化因子含量高于Treg或單個(gè)核細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)條件下的含量。以上結(jié)果證明了Treg可能通過CCL2、CCL3促進(jìn)循環(huán)纖維細(xì)胞在

12、肺部的聚集和形成，是其參與放射性肺纖維化的機(jī)制之一。
　　5.Treg通過β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞EMT參與對(duì)放射性肺纖維化中的發(fā)病。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光的結(jié)果顯示，在小鼠肺纖維化階段，肺泡上皮細(xì)胞中的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘素(N-cadherin)表達(dá)增加，并隨照后時(shí)間的延長(zhǎng)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞表面蛋白C（Pro-surfactan protein C，SPC）逐漸丟失，提示放射性肺纖維化發(fā)病過程中EMT增強(qiáng);抑制Treg后

13、，小鼠肺組織上皮細(xì)胞N-cadherin表達(dá)減弱，SPC丟失減輕，表明EMT減弱。免疫組化結(jié)果顯示，EMT重要信號(hào)通路蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在肺組織上皮細(xì)胞胞漿和胞核中表達(dá)增加;而抑制Treg后，β-catenin表達(dá)降低，提示Treg可能通過β-catenin調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞EMT參與對(duì)放射性肺纖維化中的發(fā)病。建立體外輻射誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞體系，以及小鼠肺上皮細(xì)胞系(MLE12)經(jīng)照射后與原代分離的小鼠脾臟Treg細(xì)胞共同培

14、養(yǎng)的體系。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，其EMT發(fā)生率為13.2％，顯著高于照射后的MLE12單獨(dú)培養(yǎng)(9.3％，p＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示，在共培養(yǎng)條件下，MLE12中β-catenin的表達(dá)高于MLE12單獨(dú)培養(yǎng)情況。采用RNAi下調(diào)MLE12細(xì)胞β-catenin的表達(dá)，結(jié)果表明，與未干涉細(xì)胞相比，下調(diào)β-catenin后Treg誘導(dǎo)MLE12發(fā)生EMT的比例下降(14.3％vs16.2％，p＜0.05)。上述結(jié)果

15、提示β-catenin介導(dǎo)的EMT的發(fā)生是Treg調(diào)節(jié)放射性肺纖維化發(fā)生發(fā)展的另一機(jī)制。
　　綜上所述，成功建立了放射性肺纖維化模型，證明了Treg參與放射性肺纖維化發(fā)展的過程，驗(yàn)證了Treg通過抑制Th17分化、擾亂Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡、通過趨化因子CCL2、CCL3增加纖維細(xì)胞在肺部的聚集及分化、促進(jìn)β-catenin介導(dǎo)的EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)放射性肺纖維化的形成。本課題的研究成果為利用抑制Treg的措施緩解并治療放