犬瘟熱病毒H蛋白與不同動(dòng)物SLAM相互作用致細(xì)胞融合效率差異的分子機(jī)制.pdf

1、犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的一種烈性、高度接觸性傳染病。犬瘟熱病毒屬于副粘病毒科、麻疹病毒屬，是有囊膜的單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，基因組從3'端到5'端依次編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，其中血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)分別與宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜的結(jié)合和融合。病毒特異性受體在宿主細(xì)胞表面的表達(dá)是病毒侵入的首要條件，也是決定病毒組織嗜性和發(fā)病機(jī)理的重要因素。目前，CDV已知的兩種主要細(xì)胞受體分別

2、是:信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子(Signaling Lymphocyte Activation Molecules，SLAM)和細(xì)胞粘附分子-4(nectin-4)，這兩種受體對(duì)CDV吸附侵入到宿主體內(nèi)起重要作用。
　　SLAM為犬瘟熱病毒感染宿主免疫細(xì)胞的受體，其與CDV H蛋白識(shí)別是病毒致病性的基礎(chǔ)。不同動(dòng)物SLAM可變區(qū)(V)氨基酸差異可影響受體與CDV H相互作用，進(jìn)而可能導(dǎo)致宿主對(duì)CDV易感性的不同。我們前期研究結(jié)果表明水貂對(duì)

3、CDV易感性低于貉，且同一株CDV在表達(dá)貉子SLAM受體的BHK細(xì)胞上比在表達(dá)水貂SLAM受體的細(xì)胞所引起的病毒效價(jià)高，進(jìn)一步比對(duì)SLAM氨基酸序列結(jié)果顯示水貂和貉SLAM-V區(qū)74和129位氨基酸存在V74I和R129Q突變，我們推測(cè)該2個(gè)位點(diǎn)氨基酸突變可能改變了CDV H蛋白與SLAM相互作用，并使其誘導(dǎo)的SLAM表達(dá)細(xì)胞膜融合效率的改變。本研究通過CDV H—SLAM V同源建模，SLAM蛋白74和129位氨基酸定點(diǎn)突變和表達(dá)分析

4、及CDV H/F—SLAM細(xì)胞融合等實(shí)驗(yàn)，分別在三維結(jié)構(gòu)、蛋白表達(dá)、H-SLAM相互作用等水平上開展研究。結(jié)果表明SLAM蛋白74和129位氨基酸均位于與CDV H作用界面;74、129位的氨基酸突變未明顯改變水貂、貉SLAM蛋白的表達(dá)水平，SLAM-V74I突變降低了其蛋白表達(dá)但未影響其細(xì)胞融合能力，根據(jù)流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，SLAM-V74I表達(dá)比例從95.6％下降至91.1％;水貂SLAM-R129Q突變后顯著提高CDV對(duì)細(xì)胞的融

5、合能力，體現(xiàn)在細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中，其平均合胞體數(shù)目由23.9上升至32.07;而貉SLAM-Q129R突變則顯著降低CDV對(duì)細(xì)胞的融合能力，其平均合胞體數(shù)目由19.4下降至15.8。該結(jié)果初步驗(yàn)證了我們的猜想，證實(shí)了水貂、貉74及129位氨基酸對(duì)細(xì)胞融合效率的影響。
　　其次，本研究以BHK-21細(xì)胞為親本細(xì)胞，將pDisplay-mSLAM轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，通過G418壓力篩選并結(jié)合有限稀釋法成功構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)水貂SLAM的單克隆細(xì)胞系