人組織激肽釋放酶6原核表達(dá)載體的構(gòu)建及抗體制備.pdf

1、目的:
　　 人組織型激肽釋放酶基因家族(Kallikreins,KLKs)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志家族,屬于絲氨酸蛋白酶家族,KLK6(Kallikrein6,KLK6)是該家族成員之一,編碼人組織型激肽釋放酶6(humanKallikrein6,hK6)。成熟的hK6蛋白含223個(gè)氨基酸,具有胰蛋白酶樣活性,與乳腺癌、卵巢癌、胃癌、腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。其研究目的在于構(gòu)建hK6原核表達(dá)載體并制備高效價(jià)、高特異度的多

2、克隆抗體和單克隆抗體,為建立檢測(cè)方法檢測(cè)組織和體液中hK6奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、提取人乳腺浸潤(rùn)導(dǎo)管癌組織中總RNA,反轉(zhuǎn)錄為eDNA,根據(jù)GeneBank發(fā)表的核苷酸序列D78203,設(shè)計(jì)KLK6引物,擴(kuò)增出KLK6基因片段,先克隆入pMD-19T克隆載體SacⅠ、XhoⅠ位點(diǎn),經(jīng)菌落PCR、雙酶切鑒定和基因測(cè)序后確定pMD-19T-KLK6的重組陽(yáng)性菌,然后提取質(zhì)粒,膠回收純化KLK6目的片段,克隆入pE

3、T-28b原核表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn),轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,篩選出陽(yáng)性菌落后,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)hK6融合蛋白,對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間、溫度進(jìn)行優(yōu)化并確定蛋白表達(dá)形式,擴(kuò)大培養(yǎng),大量表達(dá)蛋白,進(jìn)行鎳柱純化、SDS-PAGE及western-blot檢測(cè)。
　　 2、純化hK6融合蛋白與弗氏佐劑等體積混合,乳化均勻后,免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠,每10天加強(qiáng)免疫一次,四次免疫后抗體效價(jià)達(dá)峰值,對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行心臟采血,分離出血清,-80

4、℃冰箱保存?zhèn)溆?。BALB/c小鼠抗體效價(jià)達(dá)到105后,腹腔加強(qiáng)免疫一次,3天后取小鼠脾臟,制備脾細(xì)胞懸液,與預(yù)先培養(yǎng)并經(jīng)8-AG篩選的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng),有限稀釋法篩選穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株,制備腹水獲得單克隆抗體。間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià),純化抗體后檢測(cè)IgG亞型并進(jìn)行western-blot檢測(cè)和免疫組化檢測(cè),抗體純化后保存于-80℃冰箱備用。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建p

5、ET-28b-KLK6原核表達(dá)載體,28℃、1mMIPTG誘導(dǎo)8小時(shí)時(shí)蛋白表達(dá)達(dá)峰值,且以可溶性形式表達(dá),其hK6融合蛋白分子量為25KD。
　　 2、鎳柱純化的hK6融合蛋白免疫新西蘭大白兔和BALB/c小鼠,得到的抗血清效價(jià)為107;細(xì)胞融合后經(jīng)有限稀釋法篩選出4株分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株(DB2C4、DB3D7、BD3G7、DD385),回輸小鼠腹腔,從腹水中提取單克隆抗體,效價(jià)均為51200;IgG亞型分析均為IgG1;w