Smad4基因小RNA干擾對小鼠骨骼肌急性鈍挫傷愈合影響的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、在骨骼肌損傷修復(fù)的過程中,TGFβ是影響骨骼肌纖維化的主要細胞因子。研究發(fā)現(xiàn),它不僅引起損傷骨骼肌纖維化,在肺、腎、肝、皮膚的纖維化過程中也發(fā)揮關(guān)鍵性作用。而TGFβ的纖維化作用主要通過TGFβ-Smad信號通路來進行調(diào)控。Smad4作為Smad蛋白家族中唯一的輔助轉(zhuǎn)運蛋白,是TGFβ-Smad信號通路中的關(guān)鍵蛋白。
   本課題研究目的是應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制Smad4在小鼠骨骼肌損傷部位的表達,阻斷TGFβ-Smad信號通路

2、的傳導(dǎo),進而達到抑制骨骼肌損傷后纖維化,促進損傷愈合的作用。我們首先構(gòu)建以慢病毒為載體的Smad4 siRNA,在體外驗證能夠抑制C2C12成肌細胞的Smad4基因及蛋白表達,再將以慢病毒為載體的Smad4 RNA干擾片斷采用局部注射的方式植入小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)在局部注射部位能夠長期發(fā)揮抑制Smad4基因表達,降低Smad4蛋白分泌,阻斷TGFβ-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。我們最后發(fā)現(xiàn),注射慢病毒介導(dǎo)的Smad4-siRNA可最終抑制小鼠損傷

3、骨骼肌纖維化的形成,減輕疤痕的產(chǎn)生,并進一步改善骨骼肌收縮功能,促進骨骼肌損傷愈合。
   第一部分以慢病毒為載體的Smad4 siRNA的構(gòu)建與鑒定
   目的:構(gòu)建并鑒定以慢病毒為載體的Smad4小RNA干擾片段。
   方法:根據(jù)Smad4的基因信息,使用不同的在線siRNA序列設(shè)計軟件,設(shè)計五條針對目的基因CDS區(qū)的siRNA序列以及一條亂序RNA序列作為對照。根據(jù)每條siRNA序列,設(shè)計兩條互補的DNA

4、模板單鏈,合成相應(yīng)的DNA單鏈。將DNA單鏈退火,與siRNA質(zhì)粒表達載體(pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector)連接后進行PCR鑒定,并將質(zhì)粒進行測序。選取siRNA1、siRNA2、siRNA3三條序列進行下一步研究。將構(gòu)建成功的重組表達載體進行去內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA抽提,使用siRNA表達載體質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞,觀察病毒轉(zhuǎn)染效率。采用Real-time PCR和Western blot的方法檢測基因干預(yù)

5、后NIH3T3細胞中smad4基因和蛋白的表達情況。選取siRNA1進行下一步研究。將siRNA1轉(zhuǎn)染293T細胞,測定病毒滴度,并進行慢病毒顆粒的包裝和生產(chǎn)。
   結(jié)果:成功構(gòu)建出3條Smad4 siRNA,PCR鑒定5條克隆均為陽性克隆,并經(jīng)DNA測序,發(fā)現(xiàn)與設(shè)計序列完全吻合。將3條Smad4 siRNA及一條作為對照的Negative siRNA轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞后,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,以綠色熒光做為參照,計算

6、出轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞的效率大約為75%,基本能夠滿足實驗要求。Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比,3條siRNA均能抑制NIH3T3細胞中smad4的基因與蛋白表達(P<0.05),其中又以siRNAl的基因沉默效率最高,可達到80%以上。選取siRNA1進行下一步研究。將siRNA成功轉(zhuǎn)染293T細胞并生產(chǎn)出病毒液后,使用dPBS將病毒顆粒濃度調(diào)整至:1×104ifu/μl,-70℃保存病毒液,

7、待用。
   結(jié)論:成功構(gòu)建出Smad4 siRNA序列,發(fā)現(xiàn)能有效抑制NIH3T3細胞內(nèi)Smad4基因及蛋白的表達,有利于實驗進一步開展。
   第二部分以慢病毒為載體的Smad4 siRNA轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞及抑制Smad4表達的作用
   目的:了解以慢病毒為載體的Smad4 siRNA體外轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞的效率及抑制C2C12細胞Smad4基因及蛋白表達的能力。
   方法:將病毒液轉(zhuǎn)染

8、C2C12成肌細胞,培養(yǎng)72小時后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,并用胰酶消化后對細胞進行計數(shù),計算出感染的最佳MOI值。使用流式細胞儀進一步驗證轉(zhuǎn)染效率,計算感染的最佳MOI值。采用Real Time-PCR和Western blot方法檢測病毒轉(zhuǎn)染C2C12C成肌細胞后Smad4基因和蛋白的表達情況。
   結(jié)果:慢病毒介導(dǎo)的Smad4-siRNA體外轉(zhuǎn)染C2C12成肌細胞后,熒光顯微鏡下計數(shù)及流式細胞儀檢測均證實MOI值為

9、6時細胞轉(zhuǎn)染效率最高,可達99%以上,同時并不影響細胞生長。Real Time-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),C2C12細胞培養(yǎng)3代后,Smad4-siRNA仍然能夠有效沉默Smad4基因和蛋白的表達,沉默效率在85%以上。
   結(jié)論:以慢病毒為載體的Smad4 siRNA可成功轉(zhuǎn)染體外C2C12成肌細胞,并能有效抑制Smad4基因及蛋白的表達。
   第三部分以慢病毒為載體的Smad4 siRNA在體轉(zhuǎn)染

10、小鼠急性鈍挫傷骨骼肌及抑制Smad4表達的作用
   目的:了解以慢病毒為載體的Smad4 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠急性鈍挫傷骨骼肌的效率及抑制鈍挫傷骨骼肌Smad4基因及蛋白表達的能力。
   方法:用自制打擊裝置將72只g雌性C57b1小鼠(體重20~25)右側(cè)腓腸肌中段造成急性鈍挫傷模型,隨機分為三組(每組24只),包括:①PBS對照組;②Lv siRNA注射組;③LvNegative注射組。小鼠打擊傷后10d,分別在損

11、傷部位注射PBS0.1ml、Lv siRNA(濃度1×106ifu/μl)、LvNegative(濃度1×106ifu/μl)。分別于傷后第7、14、21、28d,各組隨機抽取6只小鼠處死取材。熒光顯微鏡下觀察局部GFP表達情況。將損傷部位骨骼肌及心臟、肝臟、腎臟、腦組織取材行Real Time-PCR和Western blot檢測Smad4基因和蛋白的表達情況,進一步了解Smad4-siRNA在小鼠體內(nèi)抑制Smad4表達的情況。

12、>   結(jié)果:以慢病毒為載體的Smad4-siRNA注射至損傷小鼠骨骼肌局部后,在LvNegative注射組和Lv siRNA注射組小鼠損傷骨骼肌部位均可檢測到GFP表達,在Lv siRNA注射組的肝臟、心臟、腎臟及腦組織內(nèi)并未檢測到GFP表達,RealTime-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn),以慢病毒為載體的Smad4-siRNA能夠有效抑制小鼠體內(nèi)損傷部位骨骼肌Smad4基因和蛋白的表達,并不影響肝臟、心臟、腎臟及腦組織

13、的Smad4基因和蛋白的表達,表明采用慢病毒局部注射的方法能夠成功將目的基因轉(zhuǎn)染小鼠損傷局部的骨骼肌細胞,并在注射部位穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物,但并不會遠處轉(zhuǎn)染其他臟器。
   結(jié)論:以慢病毒為載體的Smad4 siRNA能夠成功轉(zhuǎn)染小鼠急性鈍挫傷骨骼肌,病毒并未轉(zhuǎn)染全身其他組織。采用慢病毒局部注射的方法能夠成功將目的基因轉(zhuǎn)染小鼠損傷局部的骨骼肌細胞,并可長期發(fā)揮抑制Smad4基因及蛋白的表達,但并不影響其他組織Smad4基因及蛋白的

14、表達,是一種安全有效的方法。
   第四部分慢病毒介導(dǎo)的Smad4基因沉默對小鼠損傷骨骼肌纖維化及愈合質(zhì)量的影響
   目的:了解以慢病毒為載體的Smad4 siRNA轉(zhuǎn)染小鼠急性鈍挫傷骨骼肌后抑制骨骼肌纖維化、減輕疤痕生成,促進骨骼肌損傷修復(fù)的能力。
   方法:用自制打擊裝置將72只g雌性C57b1小鼠(體重20~25)右側(cè)腓腸肌中段造成急性鈍挫傷模型,隨機分為三組(每組24只),包括:①PBS對照組;②Lv

15、 siRNA注射組;③LvNegative注射組。小鼠打擊傷后10d,分別在損傷部位注射PBS0.1ml、Lv siRNA(濃度1×106ifu/μl)、LvNegative(濃度1×106ifu/μl)。分別于傷后第7、14、21、28d,各組隨機抽取6只小鼠處死取材。將損傷部位骨骼肌取材行Masson染色以及Vimentin和α SMA免疫組化檢測,和Vimentin,α SMA、I型膠原的Western-Blot檢測,了解各組小鼠

16、急性鈍挫傷后腓腸肌局部纖維化情況,最后生物力學(xué)檢測各組小鼠骨骼肌的強直收縮和快速顫搐收縮能力,了解小鼠損傷骨骼肌愈合情況。
   結(jié)果:小鼠骨骼肌急性鈍挫傷后14、21、28天,Masson染色發(fā)現(xiàn),Lv siRNA注射組骨骼肌疤痕生成明顯低于Lv Negative注射組和PBS對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化及Western blot檢測也發(fā)現(xiàn),小鼠骨骼肌急性鈍挫傷后14、21、28天,代表骨骼肌纖維化程度的vimenti

17、n、α SMA和I型膠原纖維表達在Lv siRNA注射組均明顯低于對照組和Lv Negative注射組。表明局部注射Smad4-siRNA慢病毒液可明顯抑制骨骼肌急性損傷后纖維化的發(fā)生,減輕疤痕生成。生物力學(xué)檢測也發(fā)現(xiàn),在急性鈍挫傷后21天及28天,Lv Smad4注射組小鼠腓腸肌的強直收縮和快速顫搐收縮要明顯高于PBS對照組和Lv Negative注射組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,表明Smad4-siRNA注射組骨骼肌愈合質(zhì)量優(yōu)于對照組和L

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