rAAV2介導bFGF基因修飾間充質干細胞對小鼠骨骼肌鈍挫傷修復的研究.pdf

1、研究目的：
　　本實驗對小鼠骨骼肌鈍挫傷造模后，應用重組腺相關病毒介導的堿性成纖維生長因子（bFGF）、間充質干細胞（MSCs）以及基因修飾的間充質干細胞分別對急性骨骼肌鈍挫傷小鼠進行治療,從組織學、生物化學等方面觀察骨骼肌損傷修復過程中損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達以及血清肌酸激酶的變化，比較不同治療方法的修復效果，豐富相應研究資料。
　　研究方法：
　　研究對象為100只清潔級雄性ICR小鼠，其中

2、20只小鼠不造模作為正常對照組（A組），對其余的小鼠進行骨骼肌鈍挫傷造模后隨機分為4組：自然愈合組（B組）、細胞組（C組）、基因組（D組）、轉基因細胞組（E組）。各組再分別設3天組、7天組、14天、21天組（每組5只）。參照羅麗等的方法建立骨骼肌鈍挫傷模型，給小鼠腹腔注射5％水合氯醛將其麻醉，用脫毛膏將小鼠右后腿的毛清理干凈，用自制的重物打擊器，將小鼠后肢置于打擊器底板上，使后肢處于伸膝，踝背屈90。位置，腓腸肌正對PVC管底端中心部位

3、（管徑大于砝碼直徑），手持20g砝碼使其從81cm高的PVC管頂端順著管內自由垂直落下打擊小鼠腓腸肌，重力為0.157N，動能為0.157J，造模后保持皮膚完整，避免感染。
　　正常對照組不做處理，其余組分別于損傷后即刻利用微量注射器和微電極推進器，向腓腸肌斜行進針，深度約3mm，分別注射注射40ul PBS、40ul MSCs（數(shù)量約為1x105）、40ul rAAV2-bFGF、40ul轉染rAAV2-bFGF的MSCs（數(shù)量

4、約為1x105），注射時間不少于3min，留針2min，分籠飼養(yǎng)。跟蹤測試各組不同時間點下列指標：骨骼肌組織形態(tài)學變化、損傷組織bFGF、膠原蛋白I、IIImRNA表達以及血清肌酸激酶的變化。
　　研究結果：
　　（1）HE染色光鏡和血漿CK活性變化提示,間充質干細胞以及堿性成纖維生長能促進大鼠急性腓腸肌鈍挫傷后肌肉再生,減少瘢痕形成，加速損傷肌肉愈合的進程,,提高肌肉愈合質量。（2）傷后各組 bFGF表達都顯著高于A組（P

5、<0.05）；隨修復時間的增加，各組bFGF呈下降趨勢，到第21天時 E組bFGF表達仍顯著高于正常對照組，各組 bFGF量由高到低為E組、C組、D組、B組、A組。（3）傷后各組膠原蛋白ImRNA表達呈上升趨勢，各組骨骼肌損傷后，各組I型膠原mRNA表達小幅上升，損傷后第7天，繼續(xù)上升，第14天開始，I型膠原mRNA表達迅速上升，在21天時達到峰值，E組膠原蛋白ImRNA表達量最低。與A組相比，除第3天外，各組均有非常顯著性差異（P<0

6、.01）。（4）各組膠原蛋白III mRNA表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第7天達到峰值，各組膠原蛋白III mRNA表達量由高到低依次是B組、D組、C組、E組、A組，說明間充質細胞及堿性成纖維生長因子抑制骨骼肌鈍挫傷小鼠損傷局部組織I、III型膠原mRNA的表達。
　　研究結論：
　　（1）成功包裝重組腺相關病毒 rAAV2-bFGF,轉染間充質干細胞后可表達報告基因，目的基因bFGF也高效表達。（2）rAAV2-bFG