小鼠骨骼肌細(xì)胞SelW基因的RNA干擾研究.pdf

1、本研究中SelenoproteinWmRNA和蛋白的下調(diào)采用RNA干擾技術(shù)，首先根據(jù)目的mRNA翻譯區(qū)序列合成了21bp長(zhǎng)的，具有特殊結(jié)構(gòu)要求的雙鏈siRNA，參照文獻(xiàn)記載，選取對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高的陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofactamine為轉(zhuǎn)染試劑，使其與合成的siRNA形成復(fù)合體，利用胞飲和范德華力作用機(jī)理，將復(fù)合體導(dǎo)入小鼠骨骼肌細(xì)胞；當(dāng)復(fù)合體成功進(jìn)入細(xì)胞后，利用細(xì)胞所特有的機(jī)制，與細(xì)胞內(nèi)特殊蛋白形成沉默復(fù)合物，發(fā)揮剪切作用，

2、達(dá)到降解目標(biāo)mRNA的目的。隨后，利用蛋白印記和熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞模型中的目標(biāo)基因及其表達(dá)蛋白的動(dòng)力學(xué)變化進(jìn)行研究，細(xì)胞狀態(tài)的變化由流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行測(cè)量。轉(zhuǎn)染效率通過轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記的與目標(biāo)序列無(wú)同源性的siRNA進(jìn)行報(bào)告。本研究平行地在原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞進(jìn)行。 在針對(duì)C2C12細(xì)胞系中SelW基因的RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，最高的干擾效率見于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染效率為50％至70％。 在陽(yáng)性小RNA效能比較實(shí)驗(yàn)中，

3、選取生物學(xué)特性穩(wěn)定的傳代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞依轉(zhuǎn)染不同的兩個(gè)合成的siRNA分為組1，組2，并按轉(zhuǎn)染試劑推薦的常規(guī)劑量，分別轉(zhuǎn)染1ug小RNA。24小時(shí)和48小時(shí)后分別進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。 在劑量反應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，選取實(shí)驗(yàn)證明具有良好效果的1號(hào)siRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將肌細(xì)胞分為6組，分別對(duì)應(yīng)6個(gè)梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以便依次梯度降低SelWmRNA水平，考察針對(duì)小鼠骨骼肌細(xì)胞的合適轉(zhuǎn)染劑量。每組依次轉(zhuǎn)染2ug，1.5ug，1.2ug

4、，1ug，0.5ug，0.25ugsiRNA，各組依次按1～6編號(hào)。24小時(shí)后分別進(jìn)行檢測(cè)。 在2個(gè)合成siRNA干擾效能比較實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在實(shí)驗(yàn)確定了小鼠肌細(xì)胞最適的siRNA轉(zhuǎn)染劑量后，進(jìn)行了干擾效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)立陽(yáng)性組、陰性組和空白對(duì)照組3組，分別轉(zhuǎn)染1號(hào)陽(yáng)性siRNA、陰性siRNA(各lug)和不轉(zhuǎn)染siRNA(不轉(zhuǎn)染任何外來(lái)物質(zhì)僅進(jìn)行培養(yǎng)基更換)。 上述所有實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，包括：流式細(xì)胞術(shù)、定量PCR

5、和Westernblot，分別針對(duì)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞狀態(tài)、目的基因和蛋白的變化。 結(jié)果： 1.兩個(gè)合成siRNA都可以引起RNA干擾，但從流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的其引起細(xì)胞凋亡結(jié)果看，二者的工作效能存在差異，1號(hào)(31.7％)優(yōu)于2號(hào)(14.5％)，因此1號(hào)siRNA選做后續(xù)實(shí)驗(yàn)之用。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)為最佳檢測(cè)時(shí)段。 2.在傳代細(xì)胞劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)轉(zhuǎn)染劑量為2ug，1.5ug，1.2ug時(shí)，會(huì)導(dǎo)致50％至70％的細(xì)胞層脫落，細(xì)

6、胞死亡過多導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法回收，使測(cè)定無(wú)法進(jìn)行；當(dāng)轉(zhuǎn)染劑量為1ug，0.5ug，0.25ug時(shí)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，凋亡率分別為32.5％，12.4％，6.58％；上述3組中SelWmRNA的量通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行了測(cè)定，分別是0.25，0.39，0.524；對(duì)蛋白檢測(cè)時(shí)，假定組6中SelW蛋白的量為50，組4，5，6中蛋白的相對(duì)量為：17.26，31.08和50。所有證據(jù)指出，1ugsiRNA為最適合劑量，可以激發(fā)最高的干擾效

7、率，并在細(xì)胞健康與轉(zhuǎn)染干擾之間維持平衡。 3.在傳代細(xì)胞RNA干擾效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，最高的凋亡率發(fā)生在RNA干擾效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，為37.5％(陽(yáng)性組)；與陰性對(duì)照組(0.93％)和空白對(duì)照組(0.7％)相比差異顯著，分別為P=3.08×10-9＜0.05，P=2.95×10-9＜0.05。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示，陽(yáng)性組細(xì)胞中SelWmRNA的量(0.275)與空白對(duì)照組(0.996)相比也下降了72.4

8、％；陰性對(duì)照組(0.9867)與空白對(duì)照組(0.996)相比下降了0.93％。蛋白含量變化的測(cè)定中，假定空白對(duì)照組中SelW蛋白的量為標(biāo)準(zhǔn)(100)，則陽(yáng)性組的SelW蛋白的相對(duì)量為：25.07；陰性對(duì)照組的SelW蛋白的相對(duì)量為：98.75；與空白對(duì)照中蛋白量相比，陽(yáng)性組與陰性組的量分別下降了74.93％，1.25％。 值得指出的是，實(shí)施于原代細(xì)胞的劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、RNA干擾效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳代細(xì)胞相似，只是因干擾而引起的量的

9、改變相對(duì)較弱：劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染過量siRNA導(dǎo)致細(xì)胞死亡；轉(zhuǎn)染1ug，0.5ug，0.25ug時(shí)，凋亡率為18.3％，8.1％，4.3％；SelWmRNA量為0.22，0.25，0.32；蛋白含量為39.5，46.2，50；RNA干擾效率檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性組、陰性組、空白對(duì)照組的凋亡率分別為20.0％，1.03％，0.4％；目的基因量平均為0.534，0.663，0.67；蛋白含量為41.2，48.8，50。 實(shí)驗(yàn)證明，一、在

10、小鼠骨骼肌細(xì)胞代謝過程中，SelenoproteinW蛋白缺失會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，SelenoproteinW蛋白的功能之一為凋亡抑制劑，揭示硒缺乏性肌病的病理機(jī)制并非僅組織變性、壞死一個(gè)途徑。二、RNA干擾存在著閾值效應(yīng)，即轉(zhuǎn)染siRNA達(dá)到相應(yīng)劑量后才會(huì)產(chǎn)生理想的干擾效果，這對(duì)于借助RNA干擾技術(shù)實(shí)施抗病毒和基因治療都具有非?，F(xiàn)實(shí)的意義。三、RNA干擾效率與基因豐度無(wú)關(guān)。雖然骨骼肌細(xì)胞中SelW基因表達(dá)量相對(duì)較低，但實(shí)驗(yàn)證明RNA干擾同