中藥安替可膠囊的物效基礎(chǔ)及配伍機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　由于環(huán)境的污染，人們生活方式的改變，惡性腫瘤已成為威脅人類生命和健康的一大殺手。近年來，關(guān)于抗腫瘤治療的研究一直在不斷發(fā)展和進(jìn)步，但依舊沒有取得突破性進(jìn)展，攻克惡性腫瘤仍然是人類面臨的一大科學(xué)難題。中醫(yī)中藥治療腫瘤因其整體性、多靶點(diǎn)、高效低毒的特征有著良好的效果，因此從祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中發(fā)掘具有顯著抗腫瘤作用的中藥及中藥復(fù)方，已成為國(guó)內(nèi)外抗腫瘤領(lǐng)域研究的一個(gè)重要思路。安替可膠囊由蟾皮和當(dāng)歸二味中藥材配伍組成，大量實(shí)踐表明，

2、其對(duì)惡性腫瘤的臨床治療具有明顯的療效。然而，安替可膠囊與其它中藥復(fù)方一樣，存在著功效成分不清楚、作用機(jī)制不明確的缺陷，制約著安替可膠囊的廣泛應(yīng)用以及在國(guó)際上的認(rèn)可。因此，對(duì)安替可膠囊進(jìn)行全面系統(tǒng)的成分分析，闡明安替可膠囊發(fā)揮抗腫瘤作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制和組方原理，進(jìn)而從中篩選出成分清楚、靶點(diǎn)確切、配伍合理、療效顯著的化學(xué)成分組方，不僅對(duì)于其二次開發(fā)有著重要的意義，更是實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的迫切需要。本研究基于此目的，采用中藥指紋

3、圖譜、血清藥物化學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)等研究手段，檢測(cè)安替可膠囊中主要化學(xué)成分及其入血移行成分、安替可膠囊及其主成分抗腫瘤活性等，藉此闡明安替可膠囊組方的科學(xué)性和合理性。
　　方法:
　　1.安替可膠囊的成分分析和質(zhì)量控制：利用高效液相色譜法建立安替可膠囊的指紋圖譜和多成分含量測(cè)定的分析方法，在此基礎(chǔ)上，對(duì)色譜圖中安替可膠囊的特征色譜峰進(jìn)行篩選，并結(jié)合已知對(duì)照品對(duì)特征色譜峰進(jìn)行化學(xué)鑒定和含量測(cè)定。色譜條件：Angilent Zorb

4、ax SB-C18色譜柱（4.6×250mm，5μm），Angilent Zorbax SB-C184.6×12.5mm保護(hù)住，柱溫：30℃；流動(dòng)相采用乙腈（A）和0.1％冰醋酸-0.5%磷酸二氫鉀水溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH＝2.4）（B）梯度洗脫的方法，時(shí)間程序?yàn)椋?%乙腈（0min），30%乙腈（20min），40%乙腈（45min），50%乙腈（70min），40%乙腈（75min），和8%乙腈（80min），流速0.8mL/min；進(jìn)

5、樣量：20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：296nm。
　　2.安替可膠囊血中移行成分分析：利用甲醇加熱回流提取后濃縮，真空冷凍干燥器揮干其中水分的方法，制備安替可膠囊、蟾皮藥材和當(dāng)歸藥材提取物的凍干粉；采用血清藥物化學(xué)的研究手段和安替可膠囊指紋圖譜的色譜條件，分析安替可膠囊凍干粉經(jīng)灌胃給藥后大鼠血清的高效液相色譜圖，并與安替可膠囊凍干粉指紋圖譜、已知對(duì)照品色譜圖、空白血清色譜圖相比較，鑒定安替可膠囊凍干粉的入血成分。
　　3.蟾皮、當(dāng)歸及

6、其配伍在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究：利用高效液相色譜技術(shù)，建立同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、遠(yuǎn)華蟾毒精和蟾毒靈4種成分血藥濃度的分析方法，色譜條件為Angilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm）， Angilent Zorbax SB-C184.6×12.5mm保護(hù)住，流動(dòng)相采用乙腈（A）和0.1%冰醋酸-0.5%磷酸二氫鉀水溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH＝2.4）（B）梯度洗脫的方法，時(shí)間程序?yàn)椋?0%

7、乙腈（0min），20%乙腈（6min），40%乙腈（40min），50%乙腈（50min），30%乙腈（55 min），和10%乙腈（60 min），流速0.8 mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)：296 nm；由此分別繪制了4種成分分別在蟾皮單味、當(dāng)歸單味和蟾皮當(dāng)歸配伍給藥條件下的血藥濃度-時(shí)間曲線，比較三組之間4種血中移行成分的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的差異，探討藥物配伍使用后對(duì)主要活性成分藥代動(dòng)力學(xué)規(guī)律的影響。

8、　　4.蟾毒靈配伍阿魏酸體外抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究：利用MTT法，分析蟾毒靈和阿魏酸對(duì)人源性肝癌細(xì)胞株HepG2、HCCLM3、Hep-3B、Bel-7404和QGY-7703的細(xì)胞毒作用并分別計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）；以Chou-Talalay聯(lián)合指數(shù)法分析蟾毒靈和阿魏酸配伍應(yīng)用對(duì)五種肝癌細(xì)胞株的藥物聯(lián)合作用指數(shù)（CI）；利用流式細(xì)胞技術(shù)分析蟾毒靈、阿魏酸及其配伍使用，對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞周期分布的影響。
　　結(jié)果:

9、　　1.安替可膠囊的成分分析和質(zhì)量控制：色譜圖中篩選出28個(gè)共有色譜峰為安替可膠囊的特征色譜峰，其中16個(gè)色譜峰經(jīng)過鑒定分別對(duì)應(yīng)：阿魏酸、日蟾毒它靈、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、沙蟾毒精、遠(yuǎn)華蟾毒精、去乙?；付舅`、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈、阿魏酸松柏酯、華蟾酥毒基、洋川芎內(nèi)酯 A、脂蟾毒配基、蒿本內(nèi)酯和正丁烯基苯酞。建立了同時(shí)測(cè)定安替可膠囊中16種成分含量的方法，該方法穩(wěn)定可行、精密度高、重復(fù)性好，各成分回收率在94.86～10

10、3.10%范圍內(nèi)，適用于安替可膠囊的質(zhì)量控制。
　　2.安替可膠囊血中移行成分分析：大鼠灌胃給予安替可膠囊凍干粉后，從血清中鑒定出9個(gè)移行成分，并確證了其中4個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分別歸屬于當(dāng)歸的阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I和蟾皮的遠(yuǎn)華蟾毒精、蟾毒靈；由此推測(cè)阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、遠(yuǎn)華蟾毒精和蟾毒靈4種成分可能為安替可膠囊發(fā)揮抗腫瘤藥效的主要活性成分。
　　3.蟾皮、當(dāng)歸及其配伍在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究：蟾皮配伍當(dāng)歸給藥與當(dāng)歸單味給藥

11、兩組相比，阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I的藥物達(dá)峰濃度，藥時(shí)曲線下面積明顯提高（P﹤0.05），平均滯留時(shí)間，血漿清除率，表觀分布容積顯著降低（P﹤0.05）；蟾皮配伍當(dāng)歸給藥與蟾皮單味給藥組相比，遠(yuǎn)華蟾毒精和蟾毒靈的藥物達(dá)峰濃度，藥時(shí)曲線下面積明顯減小（P﹤0.05），而平均滯留時(shí)間，血漿清除率，表觀分布容積顯著升高（P﹤0.05）；提示蟾皮和當(dāng)歸配伍給藥能夠有效促進(jìn)阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I在大鼠血中的吸收，降低藥物血漿清除率，提高生物利用度，同時(shí)

12、能夠有效延長(zhǎng)遠(yuǎn)華蟾毒精和蟾毒靈的作用時(shí)間并促進(jìn)藥物向組織分布。
　　4.蟾毒靈配伍阿魏酸體外抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究：MTT結(jié)果顯示，蟾毒靈細(xì)胞毒性顯著并呈明顯的量-效依賴關(guān)系，對(duì)五種肝癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度分別為57.60、83.13、74.16、27.47、52.31μM；阿魏酸細(xì)胞毒性較弱，其對(duì)五種肝癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度分別為1.98、1.89、3.20、0.97、1.16mM；Chou-Talalay法分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈和阿魏

13、酸配伍作用于五種肝癌細(xì)胞株，在大多數(shù)合用情況下聯(lián)合用藥指數(shù)CI大于1.0，兩藥聯(lián)用時(shí)互相拮抗；流式細(xì)胞技術(shù)分析結(jié)果顯示，蟾毒靈單用能夠?qū)epG2細(xì)胞阻滯于G2/M期（P﹤0.05），阿魏酸對(duì)HepG2細(xì)胞分裂G1/G0期和S期無明顯影響，兩藥配伍使用，其G2/M期阻滯作用比蟾毒靈單用更強(qiáng)（P﹤0.05）。
　　結(jié)論:
　　首次建立安替可膠囊HPLC指紋圖譜，確證其中28個(gè)共有色譜峰并歸屬其中16種成分；利用血清藥物化學(xué)方法