基于“十八反”的中藥配伍禁忌理論基礎(chǔ)研究——芫花-甘草配伍毒效表征與物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、本論文研究工作為國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目:基于“十八反”的中藥配伍禁忌理論基礎(chǔ)研究——“藻戟遂芫俱戰(zhàn)草”配伍關(guān)系與毒效表征的基礎(chǔ)研究中部分研究內(nèi)容。論文共分四個(gè)章節(jié)討論，各章節(jié)的主要內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　一、文獻(xiàn)研究
　　本部分對古今相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行梳理歸納，系統(tǒng)綜述了芫花與甘草配伍禁忌的形成源流以及配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)、生物效應(yīng)、臨床應(yīng)用等現(xiàn)代研究進(jìn)展，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了本論文的研究思路與實(shí)驗(yàn)方案。
　　二

2、、芫花-甘草配伍毒效表征及配伍禁忌機(jī)制研究
　?。ㄒ唬┸净ㄅc甘草反藥組合的毒性評價(jià)
　　1芫花、甘草各單味藥急性毒性評價(jià)
　　觀察小鼠單次灌服給予芫花或甘草產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)，評價(jià)其安全性，為比較芫花與甘草配伍前后的毒效實(shí)驗(yàn)提供劑量設(shè)計(jì)依據(jù)。結(jié)果顯示，芫花水提物L(fēng)D50為52.2 g·kg-1，95％的置信限為41.7-66.7 g·kg-1，其LD50約為臨床等效量的87倍。芫花總提物L(fēng)D50為18.7g·kg-1，

3、95％的置信限為14.9-23.5 g·kg-1。甘草水提物的最大耐受量MTD為96.2 g·kg-1，約為臨床等效量的48倍。表明芫花水提液與粉末均有毒性，甘草無明顯毒性。
　　2芫花與甘草反藥組合急性毒性評價(jià)
　　觀察小鼠灌服給予不同劑量配比的芫花-甘草合煎液或芫花總提物-甘草水提物合并液產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及死亡情況，比較不同配伍組合的毒性差異。結(jié)果顯示，小鼠單次灌服給予芫花-甘草合煎液后，小鼠出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，死亡時(shí)間多

4、在給藥2h后，死亡率大小順序?yàn)檐净?甘草1∶1合煎組＞芫花-甘草2∶1合煎組＞芫花-甘草1∶2合煎組＞芫花-甘草1∶3合煎組＞芫花-甘草3∶1合煎組，芫花單藥和甘草單藥對照組無動物死亡。灌服給予芫花總提物-甘草水提物合并液后，小鼠也出現(xiàn)明顯的中毒癥狀，但死亡時(shí)間多在給藥2h內(nèi)，死亡率大小順序?yàn)檐净?甘草1∶2合并液＞芫花-甘草3∶1合并液＞芫花-甘草1∶1合并液＞芫花-甘草1∶3合并液＞芫花單藥對照組。表明芫花與甘草合用毒性大于芫花單用

5、。
　　3芫花與甘草反藥組合長期毒性評價(jià)
　　觀察大鼠多次灌服給予不同劑量芫花-甘草合煎液產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，考察不同配伍組合的毒性差異，明確其毒性靶器官。芫花-甘草反藥組合大鼠長期毒性主要表現(xiàn)在以下方面:(1)芫花-甘草配比為1∶3.3時(shí)，在藥典臨床用量范圍內(nèi)可能產(chǎn)生對消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為大便秘結(jié)，睪丸附睪系數(shù)下降，前列腺病理異常、精子數(shù)減少。(2)芫花-甘草配比為1∶0.21，且甘草在藥典臨床用量范圍內(nèi)，芫花

6、在超過藥典臨床用量高限4倍時(shí)，即可見對泌尿系統(tǒng)的毒性，表現(xiàn)為腎系數(shù)升高，腎病理異常。(3)芫花-甘量配比為1∶53，且芫花在藥典臨床用量范圍內(nèi)，甘草在超過藥典臨床用量高限4倍時(shí)，即可見對糖脂代謝的影響，血糖、甘油三酯升高，并且肝系數(shù)升高，大劑量組大鼠出現(xiàn)消瘦現(xiàn)象。
　?。ǘ┸净ㄅc甘草反藥組合的效應(yīng)評價(jià)
　　1芫花與甘草反藥組合對正常小鼠利尿及瀉下效應(yīng)的影響
　　基于中醫(yī)藥性與配伍理論，提出甘草的甘緩之性是否平抑了芫花

7、“瀉水逐飲”藥勢的發(fā)揮和功效的實(shí)現(xiàn)？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比較了藥典范圍內(nèi)芫花與甘草合用前后對正常小鼠的利尿及瀉下作用。結(jié)果顯示，醋芫花粉末具有較強(qiáng)的利尿作用且起效較迅速，甘草水煎液可明顯抑制芫花的利尿作用。研究結(jié)果表明甘草甘緩守中之藥性可減緩芫花“瀉水逐飲”的取效特點(diǎn)，可能是芫花與甘草配伍禁忌的機(jī)制之一。
　　2芫花與甘草反藥組合對正常大鼠水鹽代謝的影響
　　基于芫花具有“瀉水逐飲”之藥勢，而甘草的糖、鹽皮質(zhì)激素樣作用產(chǎn)生“保鈉排鉀”，

8、形成“水鈉潴留”，提出兩藥合用是否加劇了芫花“瀉水”作用導(dǎo)致的水鹽代謝平衡失調(diào)？實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了芫花與甘草合用前后對正常大鼠水鹽代謝影響的評價(jià)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，甘草可抑制芫花的利尿作用，且合用后尿Na+排泄減少，尿K+排泄增加，血K+含量降低，血中醛固酮、抗利尿激素水平增加。提示甘草具有的糖、鹽皮質(zhì)激素樣作用加劇了芫花“瀉水逐飲”功效導(dǎo)致的電解質(zhì)平衡失調(diào)，是其相反的可能特征之一。
　　3芫花與甘草反藥組合對癌性腹水模型小鼠生物效應(yīng)的影響<

9、br>　　芫花具有“瀉水逐飲”之功效，藥力峻猛，適用于水氣盛、病情急、腫勢甚的實(shí)證水腫患者。本實(shí)驗(yàn)選用惡性腹水模型，在病理模型下考察芫花與甘草合用前后對癌性腹水小鼠生物效應(yīng)（腹水量、電解質(zhì)、醛固酮、抗利尿激素、心肝腎病理組織形態(tài)）的影響。結(jié)果顯示，造模后小鼠腹水量明顯增加，血漿Na+、K+、Cl-值降低，醛固酮、抗利尿激素水平升高，病理切片可見肝腎損傷。芫花單用腹水量有減少趨勢，與甘草合用腹水量無變化;芫花或甘草單用對血漿Na+、K+、

10、Cl-濃度和醛固酮、抗利尿激素影響并不顯著，但合用使血漿K+升高，醛固酮和抗利尿激素濃度也顯著升高。綜上所述，癌性腹水小鼠可導(dǎo)致水及電解質(zhì)的紊亂，芫花與甘草合用后可加重紊亂的趨勢，是其相反的可能特征之一。
　?。ㄈ┸净ㄅc甘草反藥組合的作用機(jī)制研究
　　應(yīng)用代謝組學(xué)方法，采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，對芫花單用和芫花-甘草合用的大鼠尿液、血液代謝譜進(jìn)行分析，篩選毒性作用的潛在生物標(biāo)志物，闡述芫花致毒和芫花-甘

11、草反藥組合致毒/增毒的作用機(jī)制，為揭示芫花-甘草配伍禁忌提供依據(jù)。結(jié)果表明，芫花-甘草合用的毒性反應(yīng)大于芫花單用。芫花組和芫花-甘草合用組均影響甘油磷脂通路，但芫花單用還主要影響一級膽酸生物合成通路和鞘脂代謝通路;而芫花-甘草合用則主要影響苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路、酪氨酸代謝通路和甘油脂代謝通路。兩者對不同代謝通路的調(diào)控可能是毒性差異的原因之一。
　　三、芫花與甘草配伍禁忌的物質(zhì)基礎(chǔ)研究
　?。ㄒ唬┸净ɑ瘜W(xué)成分分

12、離與結(jié)構(gòu)鑒定
　　為明確芫花的毒效物質(zhì)基礎(chǔ)，采用硅膠、大孔吸附樹脂、Sephadex LH-20柱層析及制備液相等技術(shù)對芫花進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分分離，根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)。共分離鑒定了44個(gè)化合物，包括脂肪類8個(gè)、神經(jīng)酰胺類2個(gè)、甾體類4個(gè)、萜類10個(gè)、黃酮類12個(gè)、酚類7個(gè)、脫鎂葉綠素1個(gè)，分別為:正二十四烷(1)、棕櫚酸(2)、正二十六烷醇(3)、正二十八烷醇(4)、正二十九烷醇(5)、二十八烷酸十七烷醇酯(6)、

13、棕櫚酸-α-單甘油酯(7)、十八烷酸-α-單甘油酯(8)，(2S，3S，4R，8E)-2-[(2'R)-2'-羥基二十二烷酸酰胺]-十八烷-1,3，4-三醇(9)、(2S，3S，4R，8E)-2-[(2'R)-2'-羥基二十四烷酸酰胺]-十八烷-1,3，4-三醇(10)、木栓酮(11)、δ-香樹酯酮(12)、β-谷甾醇(13)、5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3β-ol(14)、7α-羥基谷甾醇(15)、

14、胡蘿卜苷(16)、芫花酯甲(17)、芫花酯乙(18)、芫花酯丙(19)、芫花酯丁(20)、芫花酯戊(21)、genkwanine F(22)、genkwanine N(23)、Wikstroemia factorM1(24)、芫花素(25)、芹菜素(26)、洋芹素-7，4'-二甲醚(27)、金合歡素(28)、3，7-二甲氧基-5，4'-二羥基黃酮(29)、3'-羥基芫花素(30)、椴苷(31)、傘形花內(nèi)酯(32)、西瑞香素(33)、浙貝

15、素(34)、丁香樹脂醇(35)、對羥基苯甲酸(36)、瑞香醇酮(37)、瑞香烯酮(38)、芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷(39)、7-甲氧基-木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(40)、木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷(41)、芫花素-5-O-β-D-茜黃櫻草糖苷(42)、芫花素-4'-O-β-D-蘆丁糖苷(43)、173-脫鎂葉綠素乙酯(44)?；衔?-6、9-12、14-15、24、34、37-38、40、43-44為首次從芫

16、花中分離得到，并首次從該植物中分離得到神經(jīng)酰胺類、三萜類和葉綠素類化合物。研究結(jié)果為芫花與甘草反藥組合的毒效評價(jià)提供了基礎(chǔ)。
　?。ǘ┸净ǖ亩拘晕镔|(zhì)基礎(chǔ)研究
　　為明確芫花的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)，對芫花的總脂肪酸、總二萜及總黃酮部位進(jìn)行急性毒性評價(jià)，結(jié)果表明總二萜部位為芫花的毒性部位。對毒性部位中的5個(gè)代表性二萜芫花酯甲、芫花酯乙、芫花酯丙、芫花酯丁、芫花酯戊進(jìn)行整體動物和細(xì)胞毒性評價(jià)，結(jié)果顯示這5個(gè)二萜均具有明顯毒性，主要表現(xiàn)為

17、肝臟毒性、胃腸道毒性和引起動物死亡;對大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。采用代謝組學(xué)技術(shù)研究代表性毒性成分芫花酯戊引起大鼠的代謝產(chǎn)物譜改變，結(jié)果表明芫花酯戊誘導(dǎo)的肝毒性和腸道毒性主要是由于干擾了生物體的正常氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝，并可能導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)而加重毒性反應(yīng)。明確了毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及毒性靶器官，揭示了可能的毒性作用機(jī)制，為芫花的安全用藥及芫花-甘草配伍禁忌的研究提供依據(jù)。
　　（三）芫花與甘草合

18、用前后的體外化學(xué)成分變化研究
　　芫花中含有的二萜類成分是其主要毒性成分，甘草中的皂苷類成分具有表面活性作用，對脂溶性成分有一定的助溶、增溶作用，兩藥合煎甘草所含豐富的皂苷類物質(zhì)，是否促進(jìn)了芫花中脂溶性的二萜類毒性物質(zhì)的溶出釋放，導(dǎo)致毒性增加？實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜與超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜兩種液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合的手段，探討芫花/醋芫花與甘草在不同配比組合水煎過程物質(zhì)相互作用導(dǎo)致化學(xué)成分組成的變化及

19、其特點(diǎn)。結(jié)果顯示，在藥典規(guī)定的配比范圍內(nèi)隨甘草比例升高，芫花不論醋炙與否，其中的二萜類成分相對溶出率均呈上升趨勢;而芫花對甘草中的皂苷類成分和黃酮類成分相對溶出率影響較小。本研究結(jié)果證實(shí)，甘草能促進(jìn)芫花中二萜類毒性成分溶出率提高，導(dǎo)致兩藥合煎毒性顯著增加，從藥物相互作用的角度揭示了芫花與甘草配伍禁忌的可能機(jī)制。
　　（四）芫花與甘草合用前后體內(nèi)過程及相互作用研究
　　1芫花中二萜類成分的藥代動力學(xué)研究
　　二萜類成分是

20、芫花中的主要毒性成分，通過給予不同劑量的總二萜部位，評價(jià)二萜毒性與血藥濃度間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)建立的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可同時(shí)測定大鼠血漿中8個(gè)二萜類成分:芫花酯甲、芫花酯乙、芫花酯丙、芫花酯丁、芫花酯戊、genkwanine F、genkwanine N、Wikstroemia factor M1。結(jié)果顯示，除最低劑量大鼠未出現(xiàn)死亡，其余低、中、高劑量給藥后大鼠死亡率均為100％，且總二萜部位的毒性與劑量線性相關(guān)，隨劑量的升高死亡時(shí)

21、間縮短，毒性增加。二萜結(jié)構(gòu)不同，其體內(nèi)吸收特征差異較大。芫花酯丙、芫花酯戊在二萜部位中含量很低，但血藥濃度較高，且大鼠在其血藥濃度超過一定值后死亡;與之相反，genkwanine F及Wikstroemia factor M1含量最高，但血藥濃度反而最低。推測芫花酯丙、芫花酯戊很可能是芫花的毒性成分。為從體內(nèi)過程角度研究芫花與甘草配伍禁忌提供了一定的基礎(chǔ)。
　　2芫花中黃酮類成分的藥代動力學(xué)研究
　　黃酮類成分是芫花中的活性

22、成分，且含量較高。本實(shí)驗(yàn)通過建立的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時(shí)測定大鼠血漿中8個(gè)黃酮類成分:芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷，3'-羥基芫花素-5-O-β-D-葡萄糖苷，木犀草素-5-O-β-D-葡萄糖苷，芫花素-5-O-β-D-茜黃櫻草糖苷，芫花素，芹菜素，3'-羥基芫花素和3，7-二甲氧基-5，4'-二羥基黃酮。黃酮苷類成分在約1h達(dá)到最高血藥濃度，而黃酮苷元均出現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象，即在1h達(dá)到最高血藥濃度后在7h左右又出現(xiàn)一個(gè)吸收的高

23、峰，很可能是由于黃酮苷在體內(nèi)被代謝為苷元后又重新吸收。本實(shí)驗(yàn)從藥代動力學(xué)角度研究了芫花中主要活性成分黃酮的吸收過程，為從體內(nèi)過程角度研究芫花與甘草配伍禁忌提供了一定的基礎(chǔ)。
　　3芫花與甘草反藥組合毒性成分體內(nèi)過程研究
　　選擇芫花酯戊作為芫花的代表性毒性成分，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)探討其與甘草合用前后的體內(nèi)過程差異，從而分析芫花與甘草反藥組合增毒的內(nèi)在本質(zhì)。結(jié)果顯示甘草使芫花酯戊達(dá)峰時(shí)間提前，降低芫花酯戊達(dá)峰濃度，延長平均滯留時(shí)

24、間;提示甘草抑制了芫花酯戊的體內(nèi)吸收，同時(shí)抑制其代謝消除過程，長期給藥可能會產(chǎn)生蓄積中毒。芫花酯戊單用及與甘草合用后在組織中的分布均是:胃、腸＞肝臟＞腎臟＞心臟＞脾＞肺＞腦，這可能與芫花酯戊的腸道損傷和肝臟損傷有關(guān)。芫花酯戊原型主要從糞便排出，合用可抑制其排泄過程，表明甘草可減緩毒性物質(zhì)的排泄，可能與甘草對芫花的增毒機(jī)制有關(guān)。
　　四、芫花-甘草反藥組合的量-毒-效研究
　　基于多劑量、多指標(biāo)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察芫花與甘草合

25、用前后的毒性作用（對胃腸道、肝腎和生殖器官的毒性）及相關(guān)的效應(yīng)表現(xiàn)（利尿、瀉下的效應(yīng)及對胃腸道運(yùn)動功能的影響），分析配伍前后安全范圍動態(tài)變化過程，揭示芫花-甘草反藥組合的量-毒-效關(guān)系。
　?。ㄒ唬┸净ǎㄋ嵋海?甘草反藥組合的量-毒-效研究
　　芫花在藥典范圍內(nèi)單用安全，超出藥典3倍即表現(xiàn)出肝腎損傷。芫花在藥典范圍內(nèi)與甘草合用無明顯毒性;芫花為藥典高限3倍，與甘草1∶10合用表現(xiàn)為肝毒性;芫花為藥典高限9倍，與甘草1∶10

26、合用表現(xiàn)為肝毒性，1∶3合用表現(xiàn)為肝、腎和生殖器官毒性，1∶1合用表現(xiàn)為肝和生殖器官毒性;芫花為藥典高限27倍，與甘草1∶1合用表現(xiàn)為肝、腎和生殖器官毒性。雄鼠毒性反應(yīng)較雌鼠明顯。合用組芫花劑量低時(shí)甘草比例較大才可表現(xiàn)出明顯的毒性反應(yīng)，這正與體外煎煮過程導(dǎo)致的毒性成分溶出變化規(guī)律相一致，即芫花與甘草合煎隨甘草劑量增加二萜溶出增加，毒性也增加。芫花在藥典范圍內(nèi)單用具有利尿作用，瀉下作用則不明顯，對胃腸運(yùn)動無顯著影響。芫花在藥典范圍內(nèi)與甘草

27、合用利尿作用減弱，芫花為藥典高限時(shí)與甘草1∶10、1∶1、3∶1合用使胃腸運(yùn)動減弱，所致的滯留時(shí)間延長可能會增加機(jī)體對藥物中某些有毒成分的吸收，從而增毒。
　?。ǘ┸净ǎǚ勰?甘草反藥組合的量-毒-效研究
　　芫花在藥典范圍內(nèi)單用無明顯毒性反應(yīng)。芫花與甘草合用，芫花在藥典范圍內(nèi)，毒性反應(yīng)不明顯，僅可見個(gè)別生化指標(biāo)及臟器系數(shù)降低;超出藥典，隨芫花劑量增加或甘草比例加大，毒性反應(yīng)越來越明顯，芫花為藥典高限2倍，與甘草1∶10