CtBP1介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌肉瘤樣轉(zhuǎn)化.pdf

1、肝肉瘤樣癌（sarcomatiod hepatocellular carcinoma，SHC）是指腫瘤的一部分或大部分被肉瘤樣紡錘形或梭形腫瘤細(xì)胞替代，形態(tài)學(xué)上類似肉瘤的癌，原發(fā)于肝的惡性上皮性腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差，十分罕見(jiàn)。但是肝細(xì)胞肝癌在抗癌治療后發(fā)生肉瘤樣轉(zhuǎn)化率卻高達(dá)20.9％。目前肉瘤樣肝細(xì)胞肝癌缺乏有效的系統(tǒng)治療手段，故闡明肝細(xì)胞肝癌肉瘤樣轉(zhuǎn)化的發(fā)生機(jī)制，尋找高效、高選擇性的治療靶點(diǎn)對(duì)提高肝癌療效具有重要的意義。
　

2、　羧基末端結(jié)合蛋白1(C-terminal binding protien1，CtBP1)為轉(zhuǎn)錄輔抑制因子，能抑制上皮標(biāo)記、抑癌基因和促凋亡基因的表達(dá)，從而促進(jìn)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition EMT）、細(xì)胞周期進(jìn)展和抑制凋亡。
　　目的：基于以上的背景知識(shí)和我們的前期研究成果，我們的研究目的為探討CtBP1在肝細(xì)胞肝癌肉瘤樣轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用，并進(jìn)一步的為肉瘤樣肝細(xì)胞癌的診治提供新

3、的分子靶點(diǎn)。
　　方法：
　　一.CtBP1在肉瘤樣肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義
　　1.收集肝細(xì)胞癌患者組織、癌旁組織及臨床病理參數(shù)
　　收集2008-2015年桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)切除的腫瘤組織病理診斷為肉瘤樣肝細(xì)胞肝癌組織標(biāo)本13例和病理診斷為肝細(xì)胞肝癌的組織標(biāo)本23例及其癌旁組織。相對(duì)應(yīng)的癌旁組織距離腫瘤邊緣5cm。用10%福爾馬林固定所有的組織標(biāo)本，石蠟包埋。患者在手術(shù)前均未進(jìn)行過(guò)放化療治療。
　

4、　2.檢測(cè)組織標(biāo)本中CtBP1的表達(dá)
　　用HE和免疫組化法檢測(cè)組織標(biāo)本中CtBP1的表達(dá)情況。
　　二．過(guò)表達(dá)肝細(xì)胞癌細(xì)胞株的CtBP1導(dǎo)致的影響
　　1.細(xì)胞株的培養(yǎng)條件
　　人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HUH-7、7402、7404、7721及HepG2使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、相對(duì)濕度95%的養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　2.肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中CtBP1的檢測(cè)
　　提取肝癌細(xì)胞株蛋白，通

5、過(guò)Western blot法檢測(cè)CtBP1的蛋白表達(dá)水平。
　　3.質(zhì)粒提取及純化
　　從美國(guó) abcam公司購(gòu)買過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化、搖菌，提取質(zhì)粒，NaAC-乙醇沉淀法純化質(zhì)粒。
　　4.穩(wěn)定細(xì)胞株建立
　　穿梭載體PPAX2和包裝載體PMD2G與表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，生產(chǎn)慢病毒，采用Lipofectamine2000法感染肝癌細(xì)胞株7402和7404，建立穩(wěn)定攜帶CtBP1的肝癌細(xì)胞株。
　　5.過(guò)

6、表達(dá)CtBP1對(duì)7402、7404細(xì)胞的EMT和侵襲、遷移及增殖的影響
　　轉(zhuǎn)染CtBP1后，用Western blot法檢測(cè)7402、740細(xì)胞中CtBP1的表達(dá)，通過(guò)qRT-PCR、Western blot、Transwell、Boyden小室、CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT相關(guān)基因的表達(dá)、遷移侵襲能力和細(xì)胞增殖能力。結(jié)果：
　　1.從免疫組化結(jié)果顯示在癌旁組織、肝細(xì)胞肝癌組織和肉瘤樣肝細(xì)胞肝癌組織中 CtBP1的表

7、達(dá)與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)、與ki67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　2. Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞株中CtBP1的表達(dá)，結(jié)果顯示各肝癌細(xì)胞株中都有一定水平的CtBP1表達(dá)，其中HUH7、7721細(xì)胞表達(dá)較低，而7402、7404及HepG2細(xì)胞 CtBP1的蛋白水平較高。
　　3.在7402和7404細(xì)胞中外源性過(guò)表達(dá)CtBP1，用Western Blot法檢測(cè)CtBP1表達(dá)水平明顯上調(diào)。并且用Western

8、 Blot法檢測(cè)了細(xì)胞上皮性標(biāo)志E-cadherin表達(dá)下降，間充質(zhì)標(biāo)志分子N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)。因此，CtBP1引起了過(guò)表達(dá)CtBP1的7402和7404細(xì)胞的間充質(zhì)樣表型和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化樣的細(xì)胞分子標(biāo)志物的改變。
　　4. Transwell、Boyden小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確了過(guò)表達(dá)CtBP1后促進(jìn)了7402和7404細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　5. cck8和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)