豬后腎帽狀間充質細胞的發(fā)育及對腎小管上皮-間充質轉化的影響.pdf

1、目的:探討豬后腎帽狀間充質細胞(metanephric cap mesenchyme cells,MCMCs)及腎小球的發(fā)育過程,以及MCMCs對腎小管上皮-間充質轉化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)的影響。
　　方法:
　　1.豬MCMCs及腎小球發(fā)育的研究:過碘酸-希夫氏(periodic acid-Schiff,PAS)染色觀察中國實驗用小型豬不同時間點后腎帽狀間充質

2、細胞及腎小球發(fā)育過程的形態(tài)學變化;免疫熒光染色技術檢測中國實驗用小型豬胚腎不同階段腎小球足細胞、內皮細胞和系膜細胞的發(fā)育過程及相互關系。
　　2.豬MCMCs對腎小管EMT影響的研究:10ng/ml轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)分別誘導豬近端小管上皮細胞系(LLC-PK1)24h、48h、72h,建立LLC-PK1細胞EMT的體外模型;將分離的原代豬MCMCs與TGF-

3、β1誘導的LLC-PK1細胞在Transwell系統(tǒng)中共培養(yǎng),研究MCMCs對TGF-β1誘導的LLC-PK1細胞EMT的影響。
　　結果:
　　1.豬MCMCs及腎小球的發(fā)育過程:
　　(1)不同時間點豬腎小球發(fā)育的形態(tài)學改變:豬腎組織PAS染色顯示,胚胎第28天(E28d)后腎已開始發(fā)育,可見到呈“T”型分支的輸尿管芽(ureteric bud,UB),后腎間充質(metanephric mesenchyme,MM

4、)圍繞UB呈帽狀分布(帽狀間充質),并可見到典型的腎小囊體、逗號形體及“S”形體。E35d可見腎小球形成,包括近皮質生腎區(qū)的不成熟腎小球(毛細血管袢期腎小球)和近髓質成熟腎小球(腎小球毛細血管腔內可見紅細胞)。豬在E112d-E114d出生,出生后1天(P1d)、7天(P7d)和14天(P14d)腎臟繼續(xù)發(fā)育,腎臟被膜下仍有生腎區(qū)存在,仍可見到帽狀間充質、腎小囊體、逗號形體、“S”形體及毛細血管袢期腎小球;P21d生腎區(qū)消失,腎臟發(fā)生停

5、止。
　　(2)不同時間點豬后腎帽狀間充質細胞的發(fā)育過程:免疫熒光結果顯示,后腎帽狀間充質細胞標志物Six2廣泛表達于豬后腎帽狀間充質細胞,E28d表達水平最高,隨著胚腎不斷發(fā)育,腎皮質生腎區(qū)的相對厚度逐漸變薄,Six2的表達水平也逐漸降低,P21d生腎區(qū)消失,Six2的表達也隨之消失。Six2與足細胞標志物WT1同部位表達。
　　(3)豬腎小球發(fā)育不同階段固有細胞標志物的表達及形態(tài)變化:豬腎組織免疫熒光染色顯示,胚腎早期,

6、足細胞標志物WT1廣泛表達于后腎帽狀間充質細胞,相繼表達于腎小囊體、整個逗號形體、逗號形體尾部、“S”形體下端和腎小球足細胞;內皮細胞標志物CD31在胚腎早期呈散在性分布,繼而圍繞腎小囊體和逗號形體分布,然后進入“S”形體下端的血管裂隙聚集形成無管腔的“前毛細血管束”,最后定位在成熟腎小球的毛細血管內;系膜細胞標志物α-SMA在早期胚腎、腎小囊體和逗號形體階段均無表達,“S”形體早期分布于“S”形體周圍,后期進入血管裂隙,毛細血管袢期聚

7、集在腎小球血管極根部,隨著腎小球發(fā)育,逐漸向腎小球內延伸,最終表達于成熟腎小球系膜區(qū)。
　　2.豬MCMCs對腎小管EMT的抑制作用:10ng/mlTGF-β1刺激LLC-PK1細胞24h、48h、72h后可成功誘導EMT,表現為細胞形態(tài)轉變?yōu)槌衫w維細胞樣,細胞長/寬比率增加;細胞上皮標志物E-cadherin表達減少,間充質標志物α-SMA和vimentin表達增加,誘導72h后效果最明顯。原代豬MCMCs可部分抑制TGF-β1

8、誘導的LLC-PK1細胞EMT,表現為抑制細胞長/寬比率的增加,抑制E-cadherin的表達下調,抑制間充質標志物α-SMA、vimentin的表達上調,同時還可抑制EMT信號通路分子β-catenin、ZEB1的表達上調。
　　結論:豬在E28d后腎已開始發(fā)育,E35d形成腎小球,P14d-P21d腎臟發(fā)生停止;豬腎小球發(fā)育過程與人類相似,腎小球足細胞來源于Six2陽性的MCMCs;在腎小球血管叢形成過程中,足細胞、內皮細胞與