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文檔簡(jiǎn)介
1、蜜蜂作為昆蟲大家族中的一員,長(zhǎng)期以來(lái)被視為一個(gè)很好的研究對(duì)象,而且一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。中華蜜蜂(Apis cerana cerana)為東方蜜蜂中重要的亞種之一,長(zhǎng)期適應(yīng)于我國(guó)的地理特征和氣候條件,是我國(guó)特有的蜜蜂資源,具有其它蜂種不可替代的資源優(yōu)勢(shì)和研究?jī)r(jià)值。蜂王漿(Royal Jelly,RJ)是哺育蜂咽下腺與上顎腺分泌的供3日齡以內(nèi)蜜蜂幼蟲和蜂王食用的漿狀物質(zhì)。蜂王漿已被報(bào)道具有多種醫(yī)療保健和生物學(xué)功能,對(duì)蜂王漿成分及其功能的
2、研究一直是國(guó)內(nèi)外蜂學(xué)研究的重要領(lǐng)域。蜂王漿的許多功能由其所含的蛋白組分產(chǎn)生,王漿蛋白由水溶性蛋白和非水溶性蛋白組成,其中水溶性蛋白占總蛋白含量的46%~89%,為王漿蛋白的主要部分,稱為主要王漿蛋白(Major Royal Jelly Proteins,MRJPs)。目前,王漿蛋白分子水平方面的研究主要集中在MRJPs家族。
本研究從已構(gòu)建的8日齡中蜂的工蜂頭部cDNA文庫(kù)中篩選到MRJP2基因,成功獲得該基因的全長(zhǎng)eDN
3、A序列。此序列包含一個(gè)1407 bp的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),編碼一個(gè)由468個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白,預(yù)測(cè)分子量為53.06kDa,等電點(diǎn)為8.102。本研究首先通過(guò)PCR方法從AccMRJP2基因的全長(zhǎng)eDNA序列中擴(kuò)增出整個(gè)ORF,再經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后將其插入經(jīng)同樣雙酶切過(guò)的原核表達(dá)載體pET-28a(+)上,獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-AccMRJP2,后通過(guò)PCR鑒定、雙酶切
4、鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確后,再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)AccMRJP2重組蛋白,最后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示無(wú)特異性條帶出現(xiàn),之后重復(fù)多次試驗(yàn)也沒(méi)有檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá),因此我們隨后考慮對(duì)AccMRJP2基因進(jìn)行分段克隆,同時(shí)也進(jìn)行全長(zhǎng)基因的表達(dá)作為對(duì)照。為了避免信號(hào)肽可能產(chǎn)生的負(fù)作用,我們?cè)谶M(jìn)行實(shí)驗(yàn)前先將存在于此基因中的信號(hào)肽序列去除,并根據(jù)需要設(shè)計(jì)出四對(duì)
5、合適的引物,再經(jīng)PCR擴(kuò)增出各目的基因片段,長(zhǎng)度分別為420 bp、486 bp、498 bp和1356 bp,隨后分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-AccMRJP2,并鑒定各重組子是否構(gòu)建成功,再將各重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,最后經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)帶His標(biāo)簽的AeeMRJP2各片段的融合蛋白及全蛋白,并將其分別命名為His-420、His-486、His-498和His-1356,對(duì)應(yīng)的分子量分別為1
6、9.7 kDa、21.5 kDa、22.4 kDa和54.8 kDa(融合標(biāo)簽3.56kDa)。SDS-PAGE檢測(cè)各融合蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)His-420、His-486和His-498均出現(xiàn)各自的特異性條帶,但都是以包涵體的形式出現(xiàn);而His-1356沒(méi)有出現(xiàn)特異性條帶,隨后也進(jìn)行了多次重復(fù)實(shí)驗(yàn),始終沒(méi)有發(fā)現(xiàn)目的蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步探索每種蛋白的最適表達(dá)條件,我們也對(duì)各融合蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,分別設(shè)計(jì)了9組在不同誘導(dǎo)時(shí)間
7、、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度條件下的表達(dá)實(shí)驗(yàn),同樣經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)各融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,將誘導(dǎo)溫度從30℃上升到37℃有利于提高His-420融合蛋白的表達(dá)量,而對(duì)其它兩種蛋白無(wú)明顯影響;改變IPTG濃度對(duì)三種蛋白的表達(dá)量影響均不大;此步實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步確定了三種融合蛋白都是以包涵體的形式出現(xiàn)的。利用Ni-NTA親和層析柱純化各融合蛋白,得到的目的蛋白純度均較高,再經(jīng)FPLC反相層析柱進(jìn)一步純化,最后進(jìn)行LC-MS質(zhì)譜分析。質(zhì)譜結(jié)
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