小白菊內(nèi)酯對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞及其鉑耐藥細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的：上皮性卵巢癌是一種高度惡性的婦科腫瘤，由于缺乏早期診斷方法，其五年生存率徘徊在30％左右。目前卵巢癌的治療方法主要為徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類藥物為主的化療。但隨著化療時(shí)間的延長(zhǎng)，癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生的耐藥性及鉑類藥物尤其是順鉑的長(zhǎng)期應(yīng)用造成的腎毒性，也限制了鉑類藥物的應(yīng)用，這使手術(shù)后治療和化療效果處于平臺(tái)期，總的生存率沒有明顯提高，尋找有效而毒性小的抗癌藥物成為臨床治療的迫切要求，這對(duì)降低患者的死亡率、提高患者的生存質(zhì)量具有重

2、要的臨床意義。
　　 小白菊內(nèi)酯(Parthenolide，PAR)是從傳統(tǒng)藥材菊科植物中提取的一種倍半萜內(nèi)酯化合物，也是野甘菊的主要活性成分之一，用于治療發(fā)熱，偏頭疼和關(guān)節(jié)炎有著悠久的歷史。已有研究表明小白菊內(nèi)酯是一種有效的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear transicription factor-κB，NF-κB)抑制劑，它可特定作用于Iκb激酶復(fù)合體，抑制NF-κB的活性。近年來的研究證實(shí)，小白菊內(nèi)酯能在多種人類腫瘤細(xì)胞

3、株中通過誘導(dǎo)凋亡引起細(xì)胞死亡，比如結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌和多發(fā)性骨髓瘤等，此外，小白菊內(nèi)酯還能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，但目前小白菊內(nèi)酯對(duì)卵巢癌作用的研究尚未見報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)卵巢上皮性癌細(xì)胞株和卵巢癌鉑耐藥細(xì)胞株，觀察小白菊內(nèi)酯對(duì)上皮性卵巢癌細(xì)胞和卵巢癌耐藥細(xì)胞增殖的影響；比較小白菊內(nèi)酯處理兩種細(xì)胞前后NF-κB的表達(dá)情況，研究NF-κB與卵巢上皮性癌細(xì)胞株和鉑耐藥細(xì)胞株的關(guān)系及小白菊內(nèi)酯在卵巢癌細(xì)胞株中

4、對(duì)其的作用；同時(shí)用小白菊內(nèi)酯和順鉑聯(lián)合作用于卵巢癌耐藥細(xì)胞株，探討小白菊內(nèi)酯是否能增強(qiáng)卵巢癌耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性，為卵巢癌的治療提供新的思路。
　　 方法：將人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV-3及其鉑耐藥細(xì)胞株SKOV-3/DDP置于37℃，飽和濕度為5％CO2，胎牛血清濃度為10％的RPMI1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，待兩種細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。
　　 1、光鏡觀察：將不同濃度的小白菊內(nèi)酯分別作用于SKOV-

5、3和SKOV-3/DDP細(xì)胞株，在倒置顯微鏡下定時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的情況。
　　 2、MTT法：調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104，以每孔200μl培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，待兩種細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用不同濃度PAR(0、6.25、12.5、25、50，0、25、50、100、200μmol/L)分別作用SKOV-3和SKOV-3/DDP兩種細(xì)胞株于不同時(shí)間(12、24、36、48h)，以PAR0μmol/L為對(duì)照組，由于PAR是用二甲基亞砜(

6、DMSO)溶解，故另設(shè)DMSO組。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)PAR對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 3、免疫組化法：常規(guī)培養(yǎng)SKOV-3和SKOV-3/DDP細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后，胰酶消化制作細(xì)胞涂片，待細(xì)胞貼壁后使細(xì)胞同步化24h，然后加25μmol/LPAR作用6h，然后進(jìn)行染色，顯色，用圖像分析軟件分析各組吸光度值，比較各組NF-κB的表達(dá)情況。
　　 4、流式細(xì)胞術(shù)：采用碘化丙啶(propidium iodi

7、de，PI)標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小白菊內(nèi)酯是否能增強(qiáng)SKOV-3/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。實(shí)驗(yàn)分組如下：①Control組：僅以含10％胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)SKOV-3/DDP細(xì)胞②PAR組：8μmol/L，PAR作用于SKOV-3/DDP細(xì)胞③DDP組：2.5μg/ml DDP作用于SKOV-3/DDP細(xì)胞；④PAR+DDP組：8μmol/L PAR和2.5μg/ml的DDP同時(shí)作用于SKOV-3/DDP細(xì)胞。

8、
　　 5、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、倒置顯微鏡下可見，不同濃度的小白菊內(nèi)酯作用于SKOV-3和SKOV-3/DDP細(xì)胞后，隨著PAR濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的密集度明顯減少，其增殖活性明顯降低，細(xì)胞形狀逐漸由梭形變?yōu)閳A形，細(xì)胞膜也由完整逐漸變?yōu)榘櫩s，圓形細(xì)胞逐漸增多。細(xì)胞體積普遍變小，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜不完整，形態(tài)呈不規(guī)則，貼壁能力明顯減弱，最后漂浮。
　　

9、 2、MTT結(jié)果顯示，不同濃度的小白菊內(nèi)酯作用于SKOV-3和SKOV-3/DDP細(xì)胞后，隨著PAR濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種細(xì)胞的增殖活性與對(duì)照組相比都有明顯的減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均p<0.05)，最大濃度小白菊內(nèi)酯組與DMSO組相比，增殖活性明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 3、細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示：SKOV-3細(xì)胞在經(jīng)過小白菊內(nèi)酯處理前后比較，分析軟件測(cè)得處理前的吸光度值(0.3857±0.

10、012)低于處理后的吸光度值(0.4107±0.043)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；SKOV-3/DDP細(xì)胞在經(jīng)過小白菊內(nèi)酯處理前后比較，分析軟件測(cè)得小白菊內(nèi)酯處理前的吸光度值(0.4207±0.017)低于處理后的吸光度值(0.5313±0.035)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；SKOV-3和SKOV-3/DDP細(xì)胞在小白菊內(nèi)酯處理前比較，SKOV-3細(xì)胞胞核及胞漿NF-κB蛋白的表達(dá)明顯少于SKOV3/DDP細(xì)胞，SK

11、OV3細(xì)胞株的吸光度值(0.3857±0.012)低于SKOV3/DDP細(xì)胞株的吸光度值(0.4207±0.017)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；SKOV-3和SKOV-3/DDP細(xì)胞在小白菊內(nèi)酯處理后比較，兩細(xì)胞NF-κB蛋白的表達(dá)胞漿均多于胞核，但是SKOV3細(xì)胞胞核及胞漿NF-κB蛋白的表達(dá)仍然明顯少于SKOV3/DDP細(xì)胞，SKOV3細(xì)胞株的吸光度值(0.4107±0.043)低于SKOV3/DDP細(xì)胞株的吸光度值(0.5

12、313±0.035)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 4、PI標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：小白菊內(nèi)酯聯(lián)合順鉑能抑制SKOV-3/DDP細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期在S期
　　 (1)PAR組SKOV-3/DDP細(xì)胞的凋亡率(3.25±0.91)、DDP組細(xì)胞凋亡率(2.32±0.84)及PAR+DDP組細(xì)胞凋亡率(7.69±1.34)均明顯高于Control組(1.21±0.65)(均p<0.05)，PAR組SKO

13、V-3/DDP細(xì)胞的凋亡率(3.25±0.91)與DDP組細(xì)胞凋亡率(2.32±0.84)均低于PAR+DDP組細(xì)胞凋亡率(7.69±1.34)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 (2)G0/G1期SKOV-3/DDP細(xì)胞數(shù)，PAR組(53.2±1.00)、DDP組(30.7±0.65)及PAR+DDP組(29.3±0.38)明顯低于Control組(62.8±1.25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；S期SKOV-

14、3/DDP細(xì)胞數(shù)，PAR組(26.1±1.56)、DDP組(56.2±0.73)及PAR+DDP組(50.9±2.33)均明顯高于Control組(19±1.32)。
　　 結(jié)論：
　　 1、小白菊內(nèi)酯能抑制SKOV-3細(xì)胞的增殖，并具有時(shí)間-濃度依賴關(guān)系。同一濃度的小白菊內(nèi)酯隨著時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)SKOV-3細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)，小白菊內(nèi)酯隨著濃度的增大對(duì)SKOV-3細(xì)胞的抑制作用也增強(qiáng)。當(dāng)應(yīng)用12.5μmol/

15、L小白菊內(nèi)酯處理細(xì)胞36h后，其增殖抑制率達(dá)到74.22％。小白菊內(nèi)酯作用36h的IC50為10.5μmol/L。
　　 2、小白菊內(nèi)酯能抑制SKOV-3/DDP細(xì)胞的增殖，并具有時(shí)間-濃度依賴關(guān)系。同一濃度的小白菊內(nèi)酯隨著時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)SKOV-3/DDP細(xì)胞的抑制作用增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)，小白菊內(nèi)酯隨著濃度的增大對(duì)SKOV-3/DDP細(xì)胞的抑制作用也增強(qiáng)。當(dāng)應(yīng)用50μmol/L小白菊內(nèi)酯處理細(xì)胞48h后，其增殖抑制率達(dá)到68.6

16、3％。小白菊內(nèi)酯作用48h的IC50為31.8μmol/L。
　　 3、SKOV-3/DDP細(xì)胞核中NF-κB蛋白的表達(dá)量明顯多于SKOV-3細(xì)胞核，推測(cè)NF-κB在細(xì)胞核中的表達(dá)量增加可能與卵巢癌的順鉑耐藥有關(guān)。小白菊內(nèi)酯作用于SKOV-3和SKOV-3/DDP細(xì)胞，能抑制其NF-κB的活性。
　　 4、小白菊內(nèi)酯和順鉑聯(lián)合作用于卵巢癌耐藥細(xì)胞株，能增強(qiáng)耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性，小白菊內(nèi)酯單獨(dú)或聯(lián)合順鉑用藥均能將SKO