體內(nèi)構建骨軟骨復合體修復骨軟骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：關節(jié)軟骨損傷是骨科臨床的常見疾病。人口老齡化引起的關節(jié)軟骨磨損、退行性變和各種創(chuàng)傷、運動損傷造成的軟骨損傷逐日增多，已經(jīng)成為導致殘廢、影響生活質量的重要原因。20世紀80年代以來，組織工程技術的迅速發(fā)展，為這一難題的解決提供了前所未有的機遇。人們利用軟骨組織工程技術，將細胞和支架材料復合培養(yǎng)，修復軟骨缺損已經(jīng)取得了初步成效。本課題研究的目的是采用軟骨組織工程技術，體外分離骨髓間充質干細胞(MSCs)為種子細胞，經(jīng)軟骨細胞誘導生長因

2、子的誘導培養(yǎng)后，與聚羥基乙酸(poly glycolic acid; PLA)一聚乳酸(poly 1actic acid; PGA)共聚物(PLGA)支架材料復合培養(yǎng)，觀察MSCs在PLGA支架材料上黏附、伸展和增殖情況，并模仿馬賽克骨軟骨移植術在關節(jié)骨軟骨缺損深層置入MSC一支架復合體，淺層置入誘導培養(yǎng)后的MSC一支架復合體，緊密壓配，體內(nèi)構建骨軟骨復合體，觀察其修復的情況。期望能夠找到軟骨組織工程理想的種子細胞和支架材料。材料和方法

3、 1.取10-12月齡健康比格犬3只，無菌穿刺抽取髂骨骨髓7-8ml，Percoll分離 法分離骨髓間充質干細胞，進行原代、傳代細胞培養(yǎng)。取第3代的MSCs，根據(jù)是否加入TGFβ<,1>，分為二組：A組，加入TGFβ<,1>10ng/ml；B組，對照組。二組中常規(guī)加入含10％胎牛血清的DMEM液。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長狀況，誘導培養(yǎng)15天后，MTT法觀察細胞增殖狀況：細胞培養(yǎng)上清液檢測糖胺聚糖的含量；免疫組化檢測誘導細胞Ⅱ

4、型膠原的分泌。觀察骨髓間充質干細胞向軟骨細胞分化的情況。 2取經(jīng)過誘導培養(yǎng)7天的MSCs，調整細胞濃度為5x10<'6>/ml，與PLGA支架復合培養(yǎng)7天，進行復合組織的病理形態(tài)學觀察；動物實驗備用。PLGA支架及MSCs-PLGA支架復合體進行掃描電鏡觀察。觀察骨髓間充質干細胞在PLGA支架內(nèi)生長增殖情況。掃描電鏡觀察PLGA支架材料的結構、孔隙率和骨髓間充質干細胞在支架內(nèi)的黏附和生長情況。 3取10-12月齡健康比

5、格犬10只，在實驗犬的雙側股骨滑車處鉆直徑5mm，深度5mm的骨軟骨缺損，深達軟骨下區(qū)。隨機分為3組：A組，作為實驗組，10只，左膝軟骨缺損處深層植入MSCs復合PLGA支架材料，淺層植入經(jīng)過誘導培養(yǎng)的MSCs復合PLGA支架材料，緊密壓配；B組，作為陰性對照組，10只，陰性對照組，左膝軟骨缺損處植入MSCs復合PLGA支架材料；C組，空白對照組，10只，為上述兩組的右膝軟骨缺損處，不植入任何材料。分別于術后12、16周處死取材，進行大

6、體和組織學觀察。 結果 1 細胞形態(tài)學改變倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，原代細胞接種后1-3日可見少量細胞貼壁，呈短梭形。3日后出現(xiàn)細胞集落，7-8日廣泛集落形成。12-14同細胞形成單層。傳代細胞貼壁快，7-8日形成單層，細胞核大，胞漿內(nèi)顆 粒多。力入細胞因子后，細胞生長明顯加快，呈漩渦狀生長。 2 加入細胞因子TGFβ<,1>(A組)的MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖(GAG)含量和II型膠原分泌均明顯

7、高于對照組(B組)。II型膠原免疫組化陽性的MSCs胞漿染色為黃色或棕黃色。 3 電鏡觀察：掃描電鏡顯示PLGA支架呈不規(guī)則多孔狀，孔徑控制在200-300μm，孔徑率85％，孔壁厚度較均勻，為20-40μm。復合材料顯示MSCs細胞在PLGA支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見到細胞分泌的基質和細胞偽足的鉚固作用，表明支架材料具有良好的細胞親和性。 4 動物實驗結果 大體觀察：術后16周，實驗組缺損修復區(qū)組

8、織與周圍關節(jié)軟骨相整合，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無差異；陰性對照組缺損區(qū)修復組織與周圍軟骨部分整合在一起，光澤較差；空白對照組缺損處修復組織低凹，新生組織軟，無光澤，與周圍軟骨組織區(qū)別明顯。 組織學觀察：術后16周，實驗組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近，細胞排列出現(xiàn)明顯規(guī)律，表面層的軟骨細胞平行關節(jié)面排列，深層縱向排列，與透明軟骨組織相似，軟骨下骨形成，潮線基本恢復，與周圍正常軟骨連接較好。陰性

9、對照組軟骨細胞排列不規(guī)則，中央修復區(qū)大部分為纖維組織修復。空白對照組缺損區(qū)內(nèi)主要為纖維組織。 結論 1 MSCs適合成為軟骨組織工程的種子細胞。取材方便，Percoll分離法分離可 以獲取大量骨髓間充質干細胞，體外培養(yǎng)性能穩(wěn)定，易于傳代擴增，在一定 誘導條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細胞。 2 TGF-β 1在促進MSCs細胞增殖和向軟骨細胞定向分化方面有顯著的作用，均明顯高于對照組。 3 PLGA