CRISPR-Cas9n系統(tǒng)在地衣芽胞桿菌DW2中的構(gòu)建及其應(yīng)用.pdf

1、地衣芽胞桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，可以生產(chǎn)出許多各種各樣的生物制品。然而，低轉(zhuǎn)化效率和缺乏有效的基因組編輯工具阻礙了它的研究進(jìn)展。近些年來(lái)，由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有高效、易于操作、操作周期短等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注，并被應(yīng)用于各種細(xì)胞中。但是，Cas9核酸內(nèi)切酶輔以NHEJ修復(fù)途徑的基因組編輯策略在應(yīng)用過(guò)程中仍然存在一些問(wèn)題，如脫靶效應(yīng)和致死效應(yīng)等。為了解決這些問(wèn)題，Cas9的突變體Cas9n單切口酶被人們發(fā)現(xiàn)，并且常常輔以同

2、源重組的修復(fù)模式運(yùn)用在基因組編輯技術(shù)中。本研究利用一種改進(jìn)的CRISPR/Cas9n系統(tǒng)在地衣芽胞桿菌DW2中構(gòu)建了系統(tǒng)的基因組編輯策略，希望借此來(lái)提高芽胞桿菌的基因組編輯效率，并為其它基因組編輯策略的開(kāi)發(fā)提供思路。
　　本研究在穿梭載體pHY300的基礎(chǔ)上添加了Cas9n表達(dá)元件，并構(gòu)建了DW2/pCas9n過(guò)表達(dá)工程菌株。通過(guò)SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)表明，Cas9n蛋白能在地衣芽胞桿菌中表達(dá)。為了降低基因組編輯載體的負(fù)荷，將P43

3、啟動(dòng)子啟動(dòng)的Cas9n表達(dá)元件整合到地衣芽胞桿菌DW2的基因組上，并把Cas9n整合菌株命名為DWC9n。以DWC9n為出發(fā)菌株，構(gòu)建了系統(tǒng)的基因組編輯策略，包括單基因敲除、多基因同時(shí)敲除、大片段敲除、單基因整合等，大幅度提高了地衣芽胞桿菌的基因組編輯效率。
　　在本研究中，普切明合成酶基因yvmC被選擇作為靶基因，并設(shè)計(jì)特異性的gRNA序列構(gòu)建了單基因敲除策略。然后，對(duì)敲除載體同源臂的大小進(jìn)行了優(yōu)化，構(gòu)建了同源臂大小分別為0.1

4、kb+0.1kb、0.2kb+0.2kb、0.3kb+0.3kb、0.5kb+0.5kb、0.7kb+0.7kb、1.0kb+1.0kb的單基因敲除載體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，即使是在0.1kb大小同源臂的作用下，CRISPR/Cas9n系統(tǒng)也能很好地被應(yīng)用于單基因敲除，效率達(dá)51.4％。隨著同源臂大小的增加，敲除效率呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)，但是考慮到載體負(fù)荷和策略拓展的問(wèn)題，0.3kb大小的同源臂是比較合理的選擇，敲除效率達(dá)80.6％。
　　同

5、時(shí)，本研究通過(guò)將靶向不同基因的兩條特異性的gRNA串聯(lián)在一起實(shí)現(xiàn)了epr、wprA雙基因的同時(shí)敲除，敲除效率達(dá)11.6％。以pHY300載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了基于CRISPR/Cas9n的大片段敲除載體，并一次性敲除了42.7kb的大片段DNA序列，敲除效率高達(dá)79.0％。為了建立完善的CRISPR/Cas9n基因組編輯技術(shù)，將納豆激酶表達(dá)元件整合到地衣芽胞桿菌DWc9n的基因組上，整合效率達(dá)76.5％。
　　最后，為了測(cè)試建立的CR

6、ISPP/Cas9n系統(tǒng)在地衣芽胞桿菌中的適用性，通過(guò)敲除地衣芽胞桿菌胞內(nèi)、胞外蛋白酶基因來(lái)增加異源蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。利用構(gòu)建的基因組編輯策略敲除了epr、vpr、mpr、bprA、aprE、clpP、clpE、clpYQ、lonB、bacABC這些基因，獲得了工程菌株DWc9n△10。將實(shí)驗(yàn)室保存的納豆激酶表達(dá)載體pP43SNT-SsacC電轉(zhuǎn)到DWC9n和DWc9n△10中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，DWc9n△10具有良好的異