適度自噬通過抑制血管平滑肌細胞衰老對斑塊穩(wěn)定的作用機制及實驗研究.pdf

1、研究背景：目前，在全世界范圍內(nèi)由動脈粥樣硬化（AS）引起的心肌梗死和心源性猝死等急性心血管事件已經(jīng)超越腫瘤成為危害人類健康的頭號殺手。據(jù)2014年中國心血管病報告統(tǒng)計，我國心血管病現(xiàn)患人數(shù)為2.9億，意味著每10個成年人中有2個是心血管病患者，每年有超過250萬人死于急性心肌梗死和心源性猝死，占中國農(nóng)村居民主要疾病死因構(gòu)成比的44.8％，并且經(jīng)成為嚴重威脅我國居民健康的最重要的疾病之一，其發(fā)病率及死亡率逐年攀升。臨床上有相當一部分患者既

2、往無心血管疾病的相關(guān)癥狀，病情隱匿，突發(fā)的斑塊破裂導致嚴重的心血管事件，甚至威脅患者的生命。故易損斑塊（Vulnerable plaque）即包括不穩(wěn)定斑塊和有血栓形成傾向的斑塊越來越受到醫(yī)務工作者和科研人員的重視。動脈粥樣硬化斑塊的進展、穩(wěn)定甚至消退不僅取決于斑塊的大小、斑塊的構(gòu)成成分及穩(wěn)定性是衡量斑塊是否穩(wěn)定的重要因素，如何有效增加易損斑塊的穩(wěn)定性，將是減少不良心血管事件的有益措施。
　　細胞自噬（autophagy）是在外界

3、壓力刺激（比如饑餓、炎癥、氧化應激）下，細胞依賴溶酶體降解多余的或損傷的細胞內(nèi)有害成分而達到穩(wěn)定自身內(nèi)環(huán)境的目的，實際是對包括細胞器在內(nèi)的多種胞漿內(nèi)容物進行充分的循環(huán)利用。自噬又稱為Ⅱ型細胞死亡，它參與生物的生長發(fā)育中的多種過程，廣泛存在于真核細胞中，是繼凋亡之后生命科學最熱的研究領(lǐng)域。已有的研究證實，AS斑塊中三種主要細胞即平滑肌細胞、巨噬細胞和內(nèi)皮細胞均存在不同程度的自噬。自噬是影響斑塊穩(wěn)定性的重要因素之一，與AS的病理生理進程密切

4、相關(guān)。動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性取決于纖維帽的厚度和斑塊部位局部炎癥程度。斑塊破裂是由VSMCs死亡增加和分解膠原蛋白和細胞外基質(zhì)(ECM)過度，隨后可能導致心肌梗塞或中風。細胞增殖和遷移的平衡和細胞死亡和細胞衰老決定了VSMCs動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定，這些過程的調(diào)節(jié)對于動脈粥樣化斑塊的形成和斑塊的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。
　　哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶的一部分，包mTORC1和mTORC2，其中mTOR

5、C1可調(diào)節(jié)多種信號通路和生長因子，密切參與細胞的生長、增殖、自噬等新陳代謝過程，mTOR也參與了動脈粥樣硬化斑塊進展和失穩(wěn)定，因此通過調(diào)節(jié)mTOR信號通路可以干預自噬進而影響斑塊進展。大量文獻資料表明VSMCs的自噬參與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程，因而誘導VSMCs自噬可作為治療靶點來達到穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的目的。然而，斑塊中VSMCs自噬的相關(guān)機制尚未闡明。
　　正常血管壁VSMCs增殖指數(shù)很低，人類進展期動脈粥樣硬化斑塊中

6、血管壁邊緣的VSMCs增殖減少，倍增時間延長。這個對于體外培養(yǎng)的VSMCs結(jié)果提示S期百分比下降，G1期百分比增加。重要的是，這些細胞周期調(diào)控成為潛在的血管細胞衰老的標志。既往的研究結(jié)果表明，在進展期斑塊中VSMC增殖是增強而不是抑制，這可能是有益于斑塊的穩(wěn)定。同樣，如果VSMC增殖主要是修復動脈粥樣化斑塊，增強VSMCs增殖的能力也可能是對穩(wěn)定斑塊是有益的。
　　有研究表明，mTOR/UKL1/ATG13信號通路可能是雷帕霉素促

7、進VSMCs自噬的潛在的信號機制之一。然而，mTOR信號通路影響VSMCs代謝及動脈粥樣硬化進展是復雜的。因此可以通過調(diào)節(jié)mTORC1/ULK1/ATG13信號通路上下游的關(guān)鍵分子實現(xiàn)對自噬的正向或負向調(diào)控。那么，是否可通過激活或抑制 mTORC1/ULK1/ATG13通路上下游關(guān)鍵分子和蛋白，實現(xiàn)對不同階段AS斑塊內(nèi)細胞自噬的雙向調(diào)控呢？目前還沒有這方面的研究。
　　該研究旨在探討VSMCs自噬和衰老與動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性的

8、關(guān)系，及是否可通過低等劑量的雷帕霉素誘導VSMCs適度自噬，調(diào)控細胞衰老和凋亡，抑制動脈粥樣硬化斑塊的進展。
　　研究目的：
　　1.建立 ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，分別使用自噬激動劑和抑制劑干預并高脂喂養(yǎng)4周和16周后安樂死動物，獲取小鼠的腹主動脈組織，提前準備4%多聚甲醛、錫箔紙等，制備不同用途的血管組織標本。進行血管標本的HE染色、大體油紅及免疫組化染色，觀察斑塊大小、負荷及成分變化，比較各組斑塊穩(wěn)定性差異及

9、自噬標志蛋白變化。
　　2.培養(yǎng)MOVAS細胞系，經(jīng)ox-LDL共孵育并使用自噬激動劑和抑制劑干預后觀察各組細胞自噬水平及衰老程度的差異，明確雷帕霉素誘導的自噬對VSMCs生存和衰老的影響。
　　3.細胞水平的上調(diào)和下調(diào)自噬后檢測mTORC1/ULK1/ ATG13信號通路相關(guān)蛋白及衰老相關(guān)標志物的變化，明確雷帕霉素調(diào)節(jié)VSMCs自噬和衰老通過mTORC1/ULK1/ATG13信號通路起作用。
　　研究方法：
　

10、　1.選用雌性 ApoE-/-小鼠，6-8周齡，重量15-20g，并給予 apoE-/-小鼠高脂高膽固醇飲食(15%的脂肪和0.25%的膽固醇，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司)喂養(yǎng)，構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化的動物模型。分別在高脂喂養(yǎng)4周和16周后，安樂死動物，取腹主動脈的血管分別進行HE染色（觀察斑塊局部形態(tài)）和大體油紅染色（整體分布），驗證造模是否成功。
　　2. ApoE-/-小鼠被隨機分配，每組20只，分成五組：（1）對照組:小鼠

11、正常飲食4周、16周；（2）高脂組飲食(HFD)組:給與小鼠高脂飼料(含有15%的脂肪和15%膽固醇)喂養(yǎng)4周、16周；（3）低劑量雷帕霉素組:高脂飲食小鼠給與低劑量的雷帕霉素(50mg/Kg/d)喂養(yǎng)4周、16周；（4）高劑量雷帕霉素組:高脂飲食小鼠給與高劑量雷帕霉素(100 mg/Kg/d)喂養(yǎng)4周、16周；（5）3-MA組:高脂飲食小鼠給與自噬抑制劑3-MA(100 mg/Kg/d)喂養(yǎng)4周、16周。分別于4周、16周后，獲取小鼠

12、的腹主動脈組織，分別進行 HE染色、大體油紅染色及免疫組化染色（包括斑塊α-SMA免疫組化染色、斑塊CD68免疫組化染色、斑塊的天狼猩紅染色、斑塊組織的油紅染色），分別確定斑塊中各組分含量。
　　3.利用Image J分析軟件分別計算脂質(zhì)核、平滑肌細胞、巨噬細胞和膠原纖維占血管壁的比例。斑塊易損性的組織學計算公式為：(脂質(zhì)含量+巨噬細胞含量)/(平滑肌細胞含量+膠原纖維含量)×100%。
　　4.利用透射電鏡觀察腹主動脈斑塊

13、組織中自噬小體的形成及Western blot法檢測斑塊中自噬相關(guān)蛋白的表達，證實各組小鼠自噬水平的差異。
　　5.選用 MOVAS(小鼠胸主動脈平滑肌細胞系)，培養(yǎng)并傳代3次后倒置相差顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)良好并進行分組：（1）對照組：細胞與DMEM孵化；（2）ox-LDL組：使用ox-LDL(50mg/ml)共同培養(yǎng)72小時；（3）ox-LDL+低濃度的雷帕霉素組：ox-LDL預處理后的細胞與雷帕霉素(10ng/ml)再培養(yǎng)24

14、小時；（4）ox-LDL+高劑量雷帕霉素組：ox-LDL預處理后的細胞與雷帕霉素(30ng/ml)再培養(yǎng)24小時；（5）ox-LDL+3-MA組：ox-LDL預處理后的細胞與3-MA(25mg/ml)共培養(yǎng)24小時。利用透射電鏡觀察各組細胞中自噬小體的形成，細胞免疫熒光法檢測細胞LC3表達情況。
　　6.采用凱基細胞衰老檢測試劑盒檢測各組MOVAS細胞衰老情況，并計算(SA-β-Gal)陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)比值。使用流式細胞儀檢測

15、細胞周期，測定各組細胞在不同細胞周期的百分比。
　　7.各組細胞干預完成后提取細胞蛋白并用免疫印跡分析方法分析 mTORC、ULK1、p-ULK1、LC3Ⅰ/Ⅱ、ATG13、p53、p21及p16的蛋白表達水平，明確雷帕霉素調(diào)節(jié)VSMCs自噬和衰老通過mTORC1/ULK1/ATG13信號通路起作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.主動脈HE染色提示apoE-/-小鼠喂養(yǎng)4周后各組間斑塊大小差異不顯著。然而， apoE-/-

16、小鼠喂養(yǎng)16周后與HFD相比，自噬激動劑雷帕霉素組可以顯著減少斑塊面積,自噬抑制劑3-MA則有相反的趨勢。此外，油紅染色整個動脈的斑塊面積證明相比 HFD組，雷帕霉素組可顯著降低動脈粥樣硬化斑塊的面積及斑塊負荷，3-MA組作用與之相反(斑塊面積占整個血管面積的比例分別為3-MA組77.3%±0.02%與低劑量雷帕霉素組59.3%±0.01%)。
　　2.免疫組織化學染色分析 apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中各組分含量表明，低劑

17、量雷帕霉素治療后與HFD組相比明顯下降CD68占整個斑塊的百分比，而3-MA與雷帕霉素作用相反。同樣，低劑量雷帕霉素也顯著減少壞死核心區(qū)域。然而，低劑量雷帕霉素治療組比其他組相比α-SMA和膠原蛋白的在斑塊的分布比例明顯增加。進一步分析斑塊穩(wěn)定性顯示低劑量雷帕霉素顯著增加斑塊的穩(wěn)定性，而HFD和3-MA組則相反。
　　3.透射電鏡觀察雷帕霉素組自噬小體數(shù)量與3-MA組相比明顯增多，自噬小體為髓鞘樣結(jié)構(gòu)，細胞質(zhì)中泛素化包涵體聚集及空

18、泡形成增多。取小鼠主動脈組織用Western blot檢測各組斑塊中LC3、P62表達水平，低劑量雷帕霉素組中LC3II/I比值與3-MA組相比增多，P62降解增多，自噬增強。
　　4. MOVAS傳代培養(yǎng)3代后，細胞為長梭型，形態(tài)飽滿，胞體透亮，均勻分布于瓶底。經(jīng)ox-LDL干預后鏡下觀察細胞形態(tài)多樣，變圓呈球形或多角形，胞體腫脹，細胞間隙增寬，連接稀少，并且可見較多細胞脫落、漂浮于培養(yǎng)液中。
　　5.透射電子顯微鏡(TE

19、M)和免疫組織化學結(jié)果顯示，ox-LDL干預72小時后， VSMCs接受低劑量雷帕霉素后表現(xiàn)出的典型自噬增強的特征即增加LC3 II表達增加和自噬小體的形成增多。然而，3-MA組對 VSMCs自噬的抑制作用與雷帕霉素組的差異有統(tǒng)計學意義。
　　6.在 ox-LDL干預72小時后，VSMCs形態(tài)變成為擴大和扁平的形態(tài)與強陽性染色β-半乳糖苷酶染色(SA-β-Gal)。低劑量雷帕霉素治療可以顯著減少 VSMCs中衰老相關(guān)的β-半乳糖的

20、表達。然而，3-MA逆轉(zhuǎn)雷帕霉素的影響。流式細胞儀數(shù)據(jù)顯示低劑量雷帕霉素促進VSMCs促進細胞周期進程，而ox-LDL和3-MA組無此作用。我們進一步研究了衰老標記蛋白p16和p21的表達水平。免疫印跡結(jié)果顯示，ox-LDL干預后p16和p21的表達明顯升高。低劑量雷帕霉素治療可顯著降低VSMCs衰老標記物的表達，而3-MA與雷帕霉素的作用相悖。
　　7.進一步研究 VSMCs自噬和衰老的可能機制，評估了自噬相關(guān)蛋白 mTORC1

21、、ATG13的水平。免疫印跡結(jié)果表明低劑量雷帕霉素顯著mTORC1的表達減少，但增加了VSMCs中 ULK1和ATG13的蛋白質(zhì)含量，相比之下，ox-LDL誘導組含量的差異有統(tǒng)計學意義。與此同時，雷帕霉素降低ULK1的磷酸化水平。此外，低劑量雷帕霉素能抑制由降低VSMCs中p53蛋白表達。然而,3-MA組與雷帕霉素組對這些蛋白表達的影響作用相反。
　　研究結(jié)論:
　　1.低劑量的自噬激動劑雷帕霉素可以抑制動脈粥樣硬化進展，促