氟西汀經由Cav-1-PTEN-AKT-GSK-3β通路雙向調節(jié)星形膠質細胞內糖原的含量.pdf

1、前言:重度抑郁(major depressive disorder，MDD)是全球發(fā)病率最高的精神障礙類疾病，全世界有近10％的人飽受抑郁癥病痛的折磨。MDD患者臨床表現(xiàn)主要有情緒低落、快感喪失、自卑感和對原有喜歡的事物喪失興趣并伴隨某些軀體癥狀。MDD患者腦內病變涉及前額皮質（prefrontal cortex，PFC）、前扣帶回皮質、丘腦、海馬、杏仁核以及基底神經節(jié)等多個區(qū)域，并與機體能量代謝失衡、炎癥、神經可塑性改變以及轉導通路調

2、節(jié)異常相關。
　　近年來的研究表明，中樞神經系統(tǒng)(central neuron system，CNS)的重要組成成份星形膠質細胞與MDD具有密切的生物學相關性。MDD所引發(fā)的星形膠質細胞的病理改變不是反應性的細胞膠質化或膠質細胞的病理性肥大，而是細胞的膠質性退化。選擇性地破壞腦內星形膠質細胞，即可以導致實驗動物產生抑郁樣行為。腦內糖代謝率降低是MDD患者腦內能量代謝異常表現(xiàn)之一，并且該代謝率降低的幅度與病情嚴重程度相關。經帕羅西汀

3、等五羥色胺再攝取抑制劑(serotonin specificreuptake inhibitors，SSRIs)治療后，MDD患者腦內病變區(qū)域的糖代謝可以得到回升。本課題組前期研究成果表明，發(fā)生于原代培養(yǎng)的星形膠質細胞內的糖酵解對于神經細胞內K+的緩沖、神經遞質傳遞以及學習和記憶等生物學進程至關重要。
　　生物體內的糖原代謝主要受磷酸化和變構作用的調節(jié)。糖原合成激酶-3(glycogen synthase kinase3，GSK-

4、3)是參與糖原磷酸化調節(jié)的關鍵酶之一，最早發(fā)現(xiàn)于家兔骨骼肌分次提取物，存在旺和β兩種亞型。作為AKT下游的重要蛋白底物，GSK-3蛋白的活性改變常見于糖尿病和阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)，并與情感障礙類疾病密切相關。同源性磷酸酶張力蛋白(phosphatase and tensinhomolog，PTEN)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌因子，它可以通過去磷酸化作用促進PIP3轉化為PIP

5、2，抑制GSK-3β上游通路PI3K/AKT的活性。有關肺纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）可以通過特定的蛋白結構區(qū)域與PTEN蛋白結合并發(fā)生生物學相互作用，從而促進PTEN的膜錨定，最終影響其下游分子信號通路PI3K/AKT的轉導。
　　氟西汀是臨床上第一例人工合成的SSIRs類抗抑郁藥。該藥雖然能在短時間內提升突觸間隙五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的濃度，但需要2-

6、4周才能顯效。由此可見，氟西汀的藥理學作用機制尚不明了，還有待進一步的研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀的藥理學活性之一是作為激動劑直接作用于原代培養(yǎng)的星形膠質細胞表面的5-HT2B受體。急性給藥處理后，可引發(fā)上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）間接激活，進而影響星形膠質細胞內MAPK/ERK和PI3K/AKT兩大信號通路的轉導。在隨后的肝性腦病研究中，本課題組還發(fā)現(xiàn)銨鹽可以經

7、由Cav-1/PTEN/PI3K/AKT信號通路降低星形膠質細胞內GSK-3β的蛋白磷酸化水平，并影響腦內的糖原代謝。由此可以推想:氟西汀長期作用很可能是通過調節(jié)原代培養(yǎng)的星形膠質細胞內Cav-1的表達，影響星形膠質細胞內糖原的含量。針對這一假想，本論文通過一系列實驗檢測了:(i)氟西汀長期作用對星形膠質細胞內Cav-1蛋白表達的影響;(ii)氟西汀長期給藥對星形膠質細胞膜上PTEN蛋白含量以及AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的影響;

8、(iii)氟西汀長期作用對離體星形膠質細胞內糖原含量的影響。
　　方法:1、應用細胞原代培養(yǎng)技術分離并提取新生CD-1小鼠大腦皮層神經膠質細胞，經2周培養(yǎng)獲得分化成熟的星形膠質細胞。2、應用RNAi技術下調星形膠質細胞內Cav-1的表達。3、應用lysisbuffer和Trizol裂解液裂解并提取細胞胞漿內的蛋白和細胞內mRNA。4、應用特制的膜制備液裂解并提取細胞膜蛋白。5、應用Lowery法測定經lysis buffer細胞裂

9、解液收集和提取的蛋白樣品的濃度。6、應用western blotting技術檢測經不同實驗處理因素作用之后，星形膠質細胞內目的蛋白的含量和活性。7、應用RT-PCR技術檢測經不同濃度氟西汀(0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM)給藥2周后，星形膠質細胞內PTEN mRNA的表達水平。8、應用TECAN M200多功能酶標儀檢測經不同濃度氟西?。?μM和10μM）處理14天后，星形膠質細胞內NADPH熒光強度值，由此間接測得星

10、形膠質細胞內糖原的含量。9、采用one-way ANOVA方法對結果進行分析統(tǒng)計，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:1、實驗方法的鑒定。1）星形膠質細胞的原代培養(yǎng);2）Lowery法可用于本實驗中蛋白樣品的定量;3）RNAi技術下調Cav-1的表達。2、不同濃度氟西汀的急性作用。不同濃度氟西?。?.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM）急性處理細胞（10分鐘、20分鐘、40分鐘和2小時）后，可得到AKT蛋白磷酸化

11、水平的濃度時間柱狀圖。經藥物急性作用10分鐘后，只有高濃度組（5μM和10μM）樣品的AKT蛋白磷酸化水平增高;20分鐘后，AKT的蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)濃度依賴性地增高;40分鐘后，AKT磷酸化水平降低至正常水平，僅10μM組還留有微小的上升作用;2小時后，所有濃度組AKT蛋白磷酸化水平和對照組相比均無統(tǒng)計學差異。3、不同濃度氟西汀的長期作用。1）不同濃度氟西汀長期給藥可以雙向調節(jié)星形膠質細胞內Cav-1蛋白水平和膜PTEN蛋白含量，但不

12、影響細胞內PTEN蛋白的含量。其中，星形膠質細胞內Cav-1蛋白和質膜上的PTEN蛋白含量呈現(xiàn)濃度依賴性改變，低濃度組（0.1μM、0.5μM和1μM）Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量顯著減少，而高濃度組（5μM和10μM）Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量顯著增加。1μM濃度組的Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量下降最為明顯，10μM濃度組Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量的升高幅度最大。2）不同濃度

13、氟西汀慢性處理雙向調節(jié)星形膠質細胞內AKT和GSK-3β的蛋白磷酸化水平。其中，低濃度組（0.1μM、0.5μM和1μM）AKT和GSK-3β蛋白表達顯著增強，而高濃度組（5μM和10μM）的AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平則顯著下調，且高低濃度組間無統(tǒng)計學差異。3）PTEN抑制劑Bpv(HOpic)的作用。Bpv(HOpic)能夠抑制低濃度（0.1μM、0.5μM和1μM）氟西汀對AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的升高作用，同時也

14、能消除高濃度（5μM和10μM）氟西汀對AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的下調作用。4）RNAi的結果。Cav-1 siRNA轉染不能消除低濃度（0.1μM、0.5μM和1μM）氟西汀對AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的升高作用，但能消除高濃度（5μM和10μM）氟西汀對AKT蛋白磷酸化水平的下調作用。4、不同濃度氟西汀慢性處理雙向調節(jié)星形膠質細胞內糖原的含量。經1μM氟西汀作用2周后，星形膠質細胞內糖原的含量增加，而10μM氟西汀

15、作用2周后的結果與此相反。5、圖解氟西汀雙向調節(jié)星形膠質細胞內糖原含量的機制。
　　討論:高GSK-3β蛋白活性是重度抑郁和雙相情感障礙的致病因素之一，GSK-3β基因表達的上調以及蛋白磷酸化水平的降低均可導致GSK-3β活性增強。過表達GSK-3β的小鼠可呈現(xiàn)抑郁前臨床表現(xiàn)，且對長期和緩刺激(chronic moderatestimulus，CMS)的敏感性增加。氟西汀急性給藥雖然不能緩解CMS所致的臨床表征，但經氟西汀長期治療

16、后可以緩解這些行為學的異常。然而也有研究認為，抗抑郁治療會引發(fā)GSK-3β活性增高，例如長期服用舍曲林可增強老年抑郁癥患者血小板內的GSK-3β活性。本論文的研究結果為該爭議提供了一個合理解釋，即該現(xiàn)象可能是基于SSRIs對細胞內Cav-1基因表達的非線性調節(jié)。
　　與此同時，本論文的研究還發(fā)現(xiàn)，經氟西汀急性給藥之后，星形膠質細胞內AKT蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)給藥濃度依賴性地升高，但該急性激活效應維持時間很短暫。藥物作用2小時后，星形

17、膠質細胞內AKT蛋白磷酸化水平即與對照組無統(tǒng)計學差異，并且隨著給藥時間的延長，氟西汀長期作用逐漸顯現(xiàn)。此外，本論文通過應用RNAi技術以及抑制劑Bpv(HOpic)，特異性地下調Cav-1表達或抑制PTEN蛋白的活性，進一步證實了氟西汀可以經由Cav-1/PTEN/AKT/GSK-3β通路對星形膠質細胞內糖原含量進行雙向調控。
　　結論:本論文首次對氟西汀長期給藥對GSK-3β活性的雙向調控作用進行了探究:氟西汀長期給藥可通過雙向