Wnt-β-ca質(zhì)tenin下游靶基因Nedd9調(diào)節(jié)間充干細(xì)胞遷移的機(jī)制研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）免疫原性低，具有多向分化潛能，普遍存在脊椎動(dòng)物的臍帶、骨髓以及脂肪等組織中，獲取方便，來源充足，便于實(shí)現(xiàn)自體細(xì)胞移植，可以作為細(xì)胞移植治療的種子細(xì)胞。在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中，MSCs始終保持其多向分化的潛能，包括向神經(jīng)細(xì)胞的分化。在神經(jīng)退行性疾病治療過程中，由于MSCs遷移至損傷部位的細(xì)胞數(shù)量有限，給治療帶來了極大不便，因此提高M(jìn)SCs的遷移能力對(duì)治療有著重要意義。

2、　　Wnt信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生命活動(dòng)，包括細(xì)胞的增殖、分化和遷移等過程。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的核心是β-catenin入核與轉(zhuǎn)錄因子TCF結(jié)合進(jìn)而啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn) Wnt/β-catenin信號(hào)的激活能夠促進(jìn)MSCs的遷移。Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因是如何調(diào)控細(xì)胞的遷移，此類研究報(bào)道較少。Wnt/β-catenin的下游靶基因Nedd9（neural precursor ce

3、ll expressed，developmentally down regulated9）是一類黏著斑支架蛋白可以調(diào)控黏著斑的周轉(zhuǎn)。據(jù)報(bào)道，在腫瘤細(xì)胞中，Nedd9的表達(dá)可以響應(yīng) Wnt/β-catenin的變化，并影響腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和侵襲。本文是圍繞 Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因Nedd9對(duì)MSCs遷移的影響展開研究。
　　首先分離得到SD大鼠骨髓來源的MSCs，作為實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞材料。通過Boyden cham

4、ber裝置進(jìn)行群體細(xì)胞遷移分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示用50 ng/ml的經(jīng)典Wnt信號(hào)配體Wnt3a處理MSCs，與對(duì)照組相比MSCs的遷移能力提高1.6倍，相反用5μM的Wnt/β-catenin抑制劑FH535處理后，MSCs的遷移能力下降至對(duì)照組的60％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)MSCs的遷移。與此同時(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可以提高 Nedd9的表達(dá)。高表達(dá)Nedd9是否同樣促進(jìn)M

5、SCs的遷移，將在本課題中進(jìn)行研究。
　　我們以SD大鼠cDNA為模版克隆全長(zhǎng)Nedd9，構(gòu)建高表達(dá)Nedd9的重組腺病毒（Adenoverus，Ad）載體質(zhì)粒，線性化后轉(zhuǎn)入QBI-293A中進(jìn)行包裝和擴(kuò)增，并篩選出可以感染MSCs的最適腺病毒感染復(fù)數(shù)。通過Boyden chamber裝置進(jìn)行群體細(xì)胞遷移分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與Ad組相比，感染Ad-Nedd9后細(xì)胞群體水平的機(jī)動(dòng)性遷移能力顯著性提高。據(jù)報(bào)道，MSCs表達(dá)HGF（He

6、patocye growth factor）的受體c-met，體外實(shí)驗(yàn)表明HGF可以促進(jìn)MSCs的遷移。我們以HGF作為趨化性因子研究MSCs的趨化性遷移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Ad組相比，感染Ad-Nedd9后的細(xì)胞群體水平向HGF的趨化性遷移能力顯著性的提升。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)Nedd9后，HGF處理與未處理組相比遷移的細(xì)胞數(shù)目沒有顯著性變化。此外，通過Dunn chamber裝置，從單細(xì)胞水平研究高表達(dá)Nedd9的MSCs向HGF趨化性遷移

7、與Ad組相比，細(xì)胞的遷移速率明顯提高而遷移效率沒有顯著性變化。
　　MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)信號(hào)與細(xì)胞遷移密切相關(guān)。我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)的激活能增強(qiáng)MSCs的遷移能力，并且對(duì)MAPKs信號(hào)有相應(yīng)的激活。那么高表達(dá)Nedd9是否也能相應(yīng)地激活MAPKs信號(hào)？接下來，我們研究了Nedd9調(diào)控MSCs遷移的分子機(jī)制，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表

8、達(dá)Nedd9和感染Ad的MSCs中Stress-activated protein kinases(SAPK)/Jun amino-terminal kinases(JNK)、ERK1/2（extracellular regulated protein kinases）、p38/MAPK總蛋白及其磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)它們的總蛋白水平及ERK1/2和p38/MAPK的磷酸化水平?jīng)]有改變，而SAPK/JNK的磷酸化水平在高表達(dá)Nedd9的

9、MSCs中顯著性提高。
　　黏著斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）和樁蛋白（paxillin）都是黏著斑相關(guān)蛋白，對(duì)黏著斑的形成和周轉(zhuǎn)有著重要作用，前面介紹到，Nedd9是一類黏著斑支架蛋白，有文獻(xiàn)報(bào)道，在一些腫瘤細(xì)胞中 Nedd9可以調(diào)節(jié) FAK或 paxillin的活性。因此我們通過Western blot檢測(cè)黏著斑相關(guān)蛋白FAK和paxillin總蛋白及其磷酸化的變化。發(fā)現(xiàn)，在MSCs中高表達(dá)Ned

10、d9，F(xiàn)AK和paxillin總蛋白及FAK的酪氨酸397位點(diǎn)（Y397-FAK）磷酸化水平并沒有變化，而paxillin的Y118位點(diǎn)（Y118-paxillin）的磷酸化水平比 Ad組顯著性提高。由于細(xì)胞遷移與黏著斑周轉(zhuǎn)和細(xì)胞骨架重排密切相關(guān)，利用免疫熒光染色檢測(cè) Nedd9對(duì) MSCs黏著斑的形成及分布、細(xì)胞骨架重排的影響。發(fā)現(xiàn)高表達(dá) Nedd9后，黏著斑總數(shù)增多，且向細(xì)胞周邊分布，并且影響了微絲骨架的重排。
　　體外實(shí)驗(yàn)發(fā)

11、現(xiàn)高表達(dá) Nedd9可以促進(jìn) MSCs的遷移。接著我們檢測(cè) Nedd9在體內(nèi)能否促進(jìn)MSCs向損傷部位的遷移。我們通過構(gòu)建了大鼠T10脊髓全橫斷損傷模型，造模7 d后，鞘注法進(jìn)行細(xì)胞移植，再經(jīng)過7 d后，取損傷部位脊髓進(jìn)行冷凍切片，追蹤移植的細(xì)胞在脊髓損傷部位前后的分布并計(jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)，感染Ad-Nedd9的MSCs定植到損傷部位的細(xì)胞數(shù)比感染Ad組的顯著增多。
　　綜上所述，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活促進(jìn)MSCs遷移，