乙型肝炎病毒表面抗原對細(xì)胞蛋白LEF-1以及CyPA功能的影響及其意義.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)，是世界上分布最為廣泛的病毒之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球有3.5億乙肝病毒攜帶者，其中約50％在我國，是一個(gè)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。乙肝病毒的持續(xù)性感染會導(dǎo)致慢性肝炎(chronic hepatitis)，并與肝硬化(liver cirrhosis)以及肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等一

2、系列肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在乙肝病毒感染患者的血清中，除了直徑為42 nm的成熟病毒顆粒外，還能檢測到大量直徑在22 nm，主要由病毒表面抗原(hepatitisB surface antigen，HBsAg)組成的亞病毒顆粒，HBsAg顆粒與病毒顆粒之比能高達(dá)1000:1。如此大量且持續(xù)性的病毒包膜蛋白表達(dá)是乙肝病毒獨(dú)有的特征，至今尚未在其他病毒中發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。持續(xù)表達(dá)的HBsAg是慢性乙肝診斷的一個(gè)重要指標(biāo)，病人血清HBsA

3、g陽性超過6個(gè)月即被認(rèn)為罹患慢性肝炎，而且血清HBsAg的清除也是目前乙肝治療的一個(gè)難點(diǎn)。因此，研究HBsAg亞病毒顆粒持續(xù)表達(dá)的機(jī)制及其對宿主細(xì)胞功能的影響，不僅有助于深入了解乙肝病毒的致病機(jī)理，而且也為設(shè)計(jì)和開發(fā)新的針對HBsAg的藥物及制劑提供理論依據(jù)。
　　 為了研究HBsAg持續(xù)性表達(dá)對宿主細(xì)胞功能的影響，闡明HBsAg在病毒感染和致病機(jī)制中的作用，本課題的第一部分利用HepG2細(xì)胞構(gòu)建了乙肝病毒表面抗原主蛋白(hep

4、atitis B small surface antigen，SHBs)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株(HepG2-S-G2)以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒并平行傳代的對照細(xì)胞株(HepG2-Neo-F4)。應(yīng)用基因芯片技術(shù)對這兩株細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHBs表達(dá)導(dǎo)致許多細(xì)胞基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化。進(jìn)一步的功能學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，包括細(xì)胞的糖代謝和脂類代謝、細(xì)胞的生長和凋亡、細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)形成以及一些細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在內(nèi)的許多細(xì)胞功能

5、都受到了不同程度的影響。在這些基因中，淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子(lymphoid enhancer-bindingfactor1，LEF-1)基因的轉(zhuǎn)錄變化最為明顯，而且在有完整HBV病毒顆粒產(chǎn)生的HepG2.2.15細(xì)胞中LEF-1基因轉(zhuǎn)錄水平也發(fā)生了同樣趨勢的變化。此外，結(jié)合對HepG2-S-G2細(xì)胞基因表達(dá)譜的分析結(jié)果，還研究了SHBs表達(dá)對細(xì)胞功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHBs對細(xì)胞蛋白親環(huán)素A(cyclophilin A，CyPA)的分泌具

6、有促進(jìn)作用。
　　 本課題的第二部分，研究了SHBs對LEF-1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的分子機(jī)制。LEF-1是Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，對Wnt通路下游一系列效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)起著調(diào)控作用，從而影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的調(diào)控。細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及siRNA干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均證實(shí)SHBs的表達(dá)能上調(diào)LEF-1基因的轉(zhuǎn)錄水平。細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SHBs的表達(dá)影響了LEF-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布。在HepG2-Neo-F4對照細(xì)胞中

7、，LEF-1蛋白主要分布在細(xì)胞核中，而在HepG2-S-G2細(xì)胞中，LEF-1蛋白不僅在細(xì)胞核中，而且在細(xì)胞質(zhì)中也有分布。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，受到SHBs調(diào)控的是LEF-1基因的截短異構(gòu)體，而并非其全長蛋白。該截短異構(gòu)體據(jù)報(bào)道具有拮抗全長蛋白行使其正常功能的作用。這些結(jié)果提示，SHBs調(diào)控的LEF-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)并不遵循經(jīng)典的Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，SHBs對Wnt通路的影響并非激活性的，而是抑制性的。
　　 本課題的第三部分，研究了細(xì)胞

8、蛋白CyPA與SHBs相互作用的分子機(jī)制及其臨床意義。在轉(zhuǎn)染SHBs的Huh7細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，SHBs的表達(dá)能促進(jìn)CyPA分泌。該現(xiàn)象同樣存在于HBsAg陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠和HBV感染病人體內(nèi)，在轉(zhuǎn)基因小鼠和病人血清中CyPA含量較對照均有明顯的升高。為研究胞外CyPA在乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用，用尾靜脈高壓注射法將SHBs基因注入C57BL/6J小鼠體內(nèi)并使其在肝臟細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)伴隨CyPA分泌的增加，HBsAg陽性的肝細(xì)胞周圍有明顯

9、的炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。提示分泌的CyPA可能在乙肝病毒引起的應(yīng)激反應(yīng)以及炎癥反應(yīng)中起到了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。此外，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SHBs與CyPA有直接而且特異性的蛋白-蛋白相互作用。此外，用CyPA抑制劑環(huán)孢霉素A(cyclosporine A，CsA)處理細(xì)胞后，SHBs的表達(dá)有明顯的下降，提示胞內(nèi)CyPA對于乙肝病毒表面抗原的合成和折疊過程可能是必需的。
　　 本課題從轉(zhuǎn)錄體組學(xué)角度系統(tǒng)研究了SHBs持續(xù)表達(dá)對肝細(xì)