乙型肝炎病毒表面抗原抑制TLR2和TLR4信號(hào)通路的機(jī)制研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的病原體。全球目前有超過(guò)3.5億的乙肝病毒攜帶者，約90％的嬰幼兒和5％的成年人在感染HBV后會(huì)發(fā)展為慢性感染，其中部分慢性HBV感染會(huì)進(jìn)一步發(fā)展成肝硬化甚至肝癌。研究認(rèn)為，HBV慢性持續(xù)性感染與宿主不能形成有效的抗病毒反應(yīng)有關(guān)，但具體的機(jī)制并不十分明確。
　　Toll樣受體(Toll-Like Receptors，TLRs)作為一種重要的模式識(shí)別受體

2、在對(duì)抗病毒感染的過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道，HBV在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了多種拮抗TLRs反應(yīng)的策略以逃逸機(jī)體的天然免疫反應(yīng)，形成持續(xù)性的感染。本課題組前期的研究表明，慢性乙型肝炎感染患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs) TLR2和TLR4配體誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力受損，并且其細(xì)胞因子的產(chǎn)生能力與外周血中的乙型肝炎病毒表面抗原(H BsAg)濃度呈負(fù)相關(guān)，提示HBsAg在抑制TLR2和TLR4配體誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生中發(fā)揮重要的

3、作用。
　　為了確認(rèn)HBsAg抑制TLR2和TLR4配體誘導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生的現(xiàn)象并探索其中的具體機(jī)制，本課題使用THP-1巨噬細(xì)胞模型進(jìn)行了深入的研究。首先研究了HBsAg對(duì)TLR2和TLR4介導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)HBsAg可以以劑量依賴(lài)性的方式抑制TLR2介導(dǎo)的IL-12的產(chǎn)生，對(duì)IL-6、IL-8、TNF-α和IL-10沒(méi)有明顯影響。與對(duì)TLR2的影響有所不同，HBsAg在顯著抑制TLR4介導(dǎo)的IL-12的同時(shí)，亦對(duì)IL

4、-6及TNF-α的產(chǎn)生也有明顯抑制作用。TLR2與TLR4中的NF-KB通路與MAPK通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生的主要通路，研究發(fā)現(xiàn)與選擇性抑制TLR2介導(dǎo)的IL-12產(chǎn)生相對(duì)應(yīng)的是HBsAg只選擇性的抑制了MAPK-JNK通路的激活，對(duì)NF-kB、MAPK-p38及MAPK-ERK通路的激活沒(méi)有明顯影響，而對(duì)于TLR4，HBsAg除能顯著抑制MAPK-JNK通路激活外，亦對(duì)NF-KB通路、MAPK-p38通路激活有普遍的抑制。
　　

5、由于目前已有研究表明HBsAg可以通過(guò)影響TLR4介導(dǎo)NF-KB通路和MAPK通路抑制TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而HBsAg對(duì)TLR2信號(hào)通路的影響尚未有相關(guān)報(bào)道，為此主要集中于H BsAg抑制TLR2介導(dǎo)的IL-12產(chǎn)生的機(jī)制研究。IL-12是一種在抗病毒反應(yīng)中極為重要的細(xì)胞因子，HBsAg選擇性的抑制TLR2介導(dǎo)的IL-12的產(chǎn)生及JNK通路的激活，提示JNK通路的激活與IL-12的產(chǎn)生密切相關(guān)。分析表明，IL-12啟動(dòng)子上有JN

6、K激酶下游轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的結(jié)合位點(diǎn)，表明JNK在調(diào)節(jié)IL-12產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用，本課題使用JNK磷酸化的特異性抑制劑SP600125，發(fā)現(xiàn)其能特異性抑制JNK的激活及IL-12的產(chǎn)生，間接證明了HBsAg通過(guò)影響TLR2介導(dǎo)的JNK的磷酸化從而抑制IL-12的產(chǎn)生。除THP-1巨噬細(xì)胞外，本研究從健康人PBMC中分離出單核細(xì)胞并分化為巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HBsAg對(duì)人巨噬細(xì)胞中TLR2介導(dǎo)的JNK的磷酸化及IL-12產(chǎn)生也具有顯著抑制作

7、用。此外，本課題收集了23例慢性乙肝患者及16例健康志愿者的外周血樣本，檢測(cè)比較了PBMC及CD14+單核/巨噬細(xì)胞中TLR2介導(dǎo)的JNK激活及IL-12產(chǎn)生情況，發(fā)現(xiàn)與健康志愿者相比，慢性乙肝患者PBMC及CD14+單核/巨噬細(xì)胞中TLR2介導(dǎo)JNK的激活及IL-12的產(chǎn)生能力受損，進(jìn)一步驗(yàn)證了HBsAg對(duì)TLR2通路的抑制效應(yīng)。
　　無(wú)論對(duì)于TLR2還是對(duì)于TLR4，HBsAg具體如何抑制NF-KB通路和MAPK通路的激活，目

8、前還不清楚。為此本課題進(jìn)一步研究了HBsAg抑制TLR2和TLR4信號(hào)通路的作用環(huán)節(jié)及分子機(jī)制。首先發(fā)現(xiàn)HBsAg可以在一定程度上影響TLR2和TLR4細(xì)胞膜上受體的表達(dá)，另外也發(fā)現(xiàn)HBsAg可以以甘露糖受體依賴(lài)性的方式被巨噬細(xì)胞有效的內(nèi)吞，使用內(nèi)吞抑制劑及甘露糖阻斷HBsAg進(jìn)入細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)HBsAg的抑制作用被顯著削弱，表明除下調(diào)受體外，HBsAg主要通過(guò)進(jìn)入巨噬細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。SHP-1/Src是一對(duì)重要的蛋白酪氨酸磷酸酶和蛋白

9、酪氨酸激酶，在TLRs傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)使用SHP-1和Src的抑制劑，發(fā)現(xiàn)SHP-1和Src對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞中TLR2和TLR4介導(dǎo)的JNK激活及IL-12產(chǎn)生有重要的正調(diào)控作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HBsAg可以顯著抑制Src的激活，提示HBsAg進(jìn)入細(xì)胞后可能通過(guò)影響SHP-1/Src從而抑制TLR2和TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路激活及細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HBsAg對(duì)TLR2介導(dǎo)的IL-

10、12產(chǎn)生具有選擇性抑制的作用，而對(duì)TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞因子產(chǎn)生及信號(hào)通路的激活則具有普遍性抑制作用;在THP-1巨噬細(xì)胞、人巨噬細(xì)胞及慢性HBV感染患者臨床標(biāo)本等多個(gè)層面上，本研究證實(shí)HBsAg可以對(duì)JNK激活及IL-12產(chǎn)生的抑制。此外，本研究還進(jìn)一步提出了HBsAg通過(guò)進(jìn)入細(xì)胞并影響SHP-1/Src進(jìn)而抑制TLR2和TLR4信號(hào)通路激活及細(xì)胞因子產(chǎn)生的可能機(jī)制。上述研究有利于豐富人們對(duì)病毒拮抗細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為開(kāi)發(fā)新型抗