乙型肝炎病毒基因組EnhI突變分析及其意義.pdf

1、人感染乙型肝炎病毒(hepatitis b vius,HBV)后可導(dǎo)致急性自限性肝炎,或者轉(zhuǎn)為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)。盡管只有3～10％個體感染HBV后成為CHB患者,但據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計全世界超過20億人感染過HBV,CHB人口仍巨大。我國多年來一直是HBV感染的高流行區(qū),全國約有1.2億CHB患者。乙型肝炎慢性化的機制比較復(fù)雜,仍然有待進一步闡述。
　　 HBV感染人體后,特異性T、B

2、淋巴細(xì)胞可清除病毒。然而CHB患者在感染急性期HBV DNA水平較高,進入慢性期后HBV DNA水平維持在較低水平,免疫系統(tǒng)未能成功清除病毒,導(dǎo)致了HBV持續(xù)存在。目前較多的研究認(rèn)為HBV結(jié)構(gòu)基因選擇性突變逃避宿主免疫監(jiān)測,但HBV調(diào)控序列中增強子的變異對HBV基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制水平的下調(diào)作用導(dǎo)致感染慢性化的機制卻較少報道。HBV基因組上有二個增強子序列。研究表明HBV增強子Ⅰ(enhancerⅠ,EnhⅠ)對HBV基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制起

3、重要調(diào)控作用,其序列上的突變與HBV感染慢性化的相關(guān)性未見報道。
　　 本研究擬選取CHB患者,采用PCR技術(shù)對HBV EnhⅠ區(qū)域DNA進行擴增并直接測序,采用Genotyping軟件分析序列并鑒定其基因型(genotype),利用DNAMAN軟件將獲得的HBV序列與genebank上相應(yīng)基因型HBV參考株序列比對以分析變異,同時檢測血清中HBV DNA水平、免疫學(xué)指標(biāo)HBsAg、HBeAg滴度,分析EnhⅠ基因變異與HBV

4、DNA水平、HBsAg和HBeAg滴度的關(guān)聯(lián)性,以分析EnhⅠ基因變異對乙肝慢性化的影響。
　　 目的(1)比較Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix擴增HBV靶DNA保真度影響。(2)研究江西地區(qū)CHB患者體內(nèi)HBV EnhⅠ區(qū)域基因變異。(3)研究CHB患者HBV EnhⅠ基因變異對血清HBV DNA水平及HBsAg、HBeAg滴度影響。
　　 方法：(1)取CHB患者血清與

5、陰性對照血清標(biāo)本各一份,抽提血清中DNA,采用Taq PCR MasterMix和Taq Plus PCR MasterMix分別擴增HBV DNAnt835-nt1396片段,PCR產(chǎn)物測序并DNAMAN軟件進行比對。(2)收集來我院就診的CHB患者70名,其中“大三陽”35例,“小三陽”35例,健康體檢者2名血清,PCR擴增HBV EnhⅠ基因,產(chǎn)物測序后利用Genbank中Genotyping對HBV進行分型,利用DNAMAN軟件

6、與標(biāo)準(zhǔn)株比對分析DNA序列中的變異位點。熒光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)法定量檢測血清HBV DNA拷貝數(shù),倍比稀釋血清后用ELISA法檢測HBsAg、HBeAg滴度。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析,HBV DNA拷貝數(shù)以其對數(shù)值計算(x)±S,滴度均值采用幾何均數(shù)表示。陽性率比較采用x2檢驗,組間比較HBV DNA拷貝數(shù)陽性對數(shù)均值差異采用多應(yīng)變量方差分析,兩兩比較均采用不假

7、定方差相等Dunnett’s T3檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：(1)二種PCR試劑均能特異地擴增出HBV靶基因片段,PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果顯示,Taq PCR MasterMix擴增產(chǎn)物與Taq Plus PCR MasterMix擴增產(chǎn)物相比,產(chǎn)生了nt1390缺失和nt1389T→C及nt1392G→T二個突變位點。(2)70例乙肝患者HBV DNA測序后經(jīng)Genotyping比對,均屬于B型,與參考

8、序列AF100309同源性最高,CHB患者HBV ErdaⅠ主要變異位點為:nt1010A→T,nt1013G→A,nt1031T→C,nt1034A→G,nt1053C→T,nt1082A→T,nt1133G→A,nt1167C→T,nt1223C→A,nt1227G→C,nt1230A→C,nt1241T→A,nt1244G→A,nt1246C→A,m1251C→G,m1289A→C,nt1349A→C。(4)CHB患者HBV En

9、hⅠ區(qū)域nt1133G→A變異對應(yīng)的HBV DNA拷貝數(shù)與HBsAg、HBeAg滴度明顯降低。
　　 結(jié)論：(1)兩種不同PCR試劑中Taq和Pfu混合DNA聚合酶的Taq Plus PCRMasterMix試劑催化PCR反應(yīng)中HBV靶DNA片段擴增的保真度高于Taq DNA聚合酶。(2)江西地區(qū)乙肝患者感染HBV基因型主要為B型,HBV EnhⅠ區(qū)域nt1133G→A可降低EnhⅠ功能,下調(diào)HBV基因表達,ErdaⅠ區(qū)域基因變