DNA聚合酶βR137Q突變影響小鼠胚胎發(fā)育的研究.pdf

1、脫氧核糖核酸(DNA)是生命遺傳信息的載體。DNA分子的完整性和穩(wěn)定性對于細胞的存活和正常的生命活動具有重要意義。DNA聚合酶β(Polβ)是堿基切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵酶，在維持基因穩(wěn)定性和完整性的過程中起著重要作用。PolβR137Q位點是將Polβ的第137位精氨酸替換成谷氨酰胺，實驗室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該位點突變會降低DNA堿基切除修復(fù)效率，而降低DNA堿基切除修復(fù)效率的分子機制目前還不清楚。
　　本研究通過經(jīng)典的基因打靶的方法

2、成功獲取了R137Q突變的轉(zhuǎn)基因小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，R137Q突變的純合小鼠的出生率顯著低于野生型對照小鼠，對孕鼠進行解剖后發(fā)現(xiàn)，R137Q小鼠E15.5，E17.5和E19.5天的胚胎體型和體重都顯著低于野生型小鼠胚胎。免疫組化實驗表明，R137Q小鼠胚胎增殖顯著低于野生型小鼠。胚胎成纖維細胞(MEFs)的細胞生長曲線進一步證實了免疫組化實驗的結(jié)果。對磷酸化細胞周期檢驗點蛋白pCHK1進行檢測后發(fā)現(xiàn)，pCHK1在R137Q細胞中的表達量顯

3、著高于對照組，表明R137Q細胞周期檢驗點被激活。同時，TUNEL凋亡測定發(fā)現(xiàn)，R137Q細胞存在更高的凋亡比例。
　　R137Q細胞增殖較慢并且凋亡增加同時細胞周期檢驗點被激活，而只有當(dāng)細胞周期異常時檢驗點才會被激活，基于此我們觀察DNA結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。通過核型分析發(fā)現(xiàn)，R137Q細胞內(nèi)存在更多的染色體斷裂?？紤]到Polβ是堿基切除修復(fù)中的關(guān)鍵酶，Polβ位點突變可能會影響DNA堿基切除修復(fù)能力。于是采用組織裂解液和原代胚胎成

4、纖維細胞裂解液來重構(gòu)短片段堿基切除修復(fù)(SP-BER)和長片段堿基切除修復(fù)(LP-BER)過程。實驗結(jié)果顯示，與WT相比，R137Q小鼠的組織和細胞裂解液均不能有效修復(fù)DNA損傷，R137Q細胞BER修復(fù)效率明顯降低，提示細胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)出現(xiàn)障礙。伴隨著R137Q細胞堿基切除修復(fù)效率的降低，細胞進行DNA修復(fù)時產(chǎn)生大量的DNA中間產(chǎn)物如DNA斷裂，免疫印跡和免疫熒光實驗結(jié)果顯示R137Q細胞存在著更多的DNA雙鏈斷裂。之前體外

5、的研究已經(jīng)表明，R137位點的突變導(dǎo)致了Polβ聚合酶活性的降低和堿基切除修復(fù)效率的下降。該結(jié)果表明體內(nèi)的R137Q突變影響了聚合酶活性和堿基切除效率，進而導(dǎo)致了DNA雙鏈斷裂和染色體異常。
　　此外，通過烷化劑和氧化劑處理細胞來模擬正常生理條件下細胞所受的各類DNA損傷刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用MMS和雙氧水分別處理純合子的R137QMEFs，雜合子WT/R137Q MEFs和野生型WT MEFs之后，R137Q純合子MEFs的生存率

6、大大降低，磷酸化的組蛋白H2AX表達量顯著增加，這一結(jié)果表明，R137Q突變增加了細胞對DNA損傷試劑的敏感性，誘發(fā)了更多的DNA損傷。
　　綜上，實驗通過R137Q的轉(zhuǎn)基因小鼠，用體內(nèi)的實驗結(jié)果證明，R137是Polβ的關(guān)鍵位點，R突變成Q導(dǎo)致了Polβ功能受損，DNA修復(fù)能力下降以及基因組的不穩(wěn)定，最終引起了細胞和小鼠整體的生理功能異常。我們的結(jié)果再次證實了Polβ結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于維持生物體正常生命活動的重要作用。本研究