細(xì)胞周期蛋白D1在支氣管哮喘氣道重塑中的作用及藥物干預(yù)研究.pdf

1、支氣管哮喘(簡稱哮喘)的發(fā)生主要與變態(tài)反應(yīng)、氣道炎癥、神經(jīng)因素等相互作用有關(guān)，氣道重塑性結(jié)構(gòu)改變則貫穿于疾病的發(fā)展過程始終。氣道上皮間葉區(qū)帶處平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等受刺激后引發(fā)一系列結(jié)構(gòu)改變即為氣道重塑。氣道重塑導(dǎo)致肺功能日趨下降，給哮喘的治療帶來了很大的困難。目前氣道重塑的發(fā)生機(jī)制仍不十分清楚。因此，進(jìn)一步研究氣道重塑的發(fā)生機(jī)制對于我們?nèi)?、深入地了解哮喘本質(zhì)以及治療哮喘尤其是頑固性哮喘具有重要意義。 本研究共分為兩部分：第

2、一部分，在建立哮喘小鼠模型的基礎(chǔ)上，研究哮喘小鼠肺組織中細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表達(dá)情況，結(jié)合肺功能檢測分析CyclinD1在氣道重塑過程中的作用，并通過檢測細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellularsignal-regulatedkinase，ERK)與CyclinD1的表達(dá)相關(guān)性，進(jìn)一步探討CyclinD1在哮喘中的作用機(jī)制。第二部分，研究應(yīng)用白三烯受體拮抗劑(孟魯司特鈉)干預(yù)對哮喘小鼠肺組織中CyclinD1的表

3、達(dá)影響及對哮喘氣道重塑的作用，探討白三烯受體拮抗劑在哮喘治療中的作用。 本研究探討了CyclinD1參與哮喘氣道重塑的作用及機(jī)制，主要結(jié)果如下： 1、應(yīng)用雞卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)致敏和激發(fā)BALB/c小鼠建立哮喘模型。通過檢測其病理形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及病理生理學(xué)等方面的多種指標(biāo)，證實模型存在哮喘及氣道重塑的特征。對支氣管肺泡灌洗液(Bronchialalveolarlavagefluid，BALF)分析提示

4、哮喘組嗜酸粒細(xì)胞絕對計數(shù)及分類計數(shù)與正常組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；應(yīng)用動物肺功能儀對小鼠呼氣阻力(Re)檢測發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠Re較正常組為高(P＜0.05)；蘇木素伊紅(Hematoxylinandeosin，HE)染色顯示哮喘組出現(xiàn)嗜酸粒細(xì)胞浸潤增多、纖毛脫失、粘液栓形成、平滑肌細(xì)胞層增厚等改變，而正常組無上述改變；對圖像進(jìn)行分析提示氣道壁厚度及平滑肌細(xì)胞面積隨霧化時間延長而增加，哮喘組與正常組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義

5、(P＜0.05)。 2、分別應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(Reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT-PCR)、實時定量(real-time)PCR及Western-blot法來測定肺組織中CyclinD1mRNA水平表達(dá)變化及CyclinD1蛋白水平表達(dá)變化。RT-PCR和Real-timePCR檢測提示哮喘組CyclinD1的mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.05)，且隨

6、OVA霧化時間的延長其表達(dá)量逐漸增加；Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，CyclinD1在哮喘組蛋白表達(dá)量較正常組為高(P＜0.01)，與mRNA表達(dá)變化相一致。 3、通過RT-PCR法檢測ERK在各組小鼠肺組織中的表達(dá)情況，觀察ERK1/2的表達(dá)與CyclinD1的表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果顯示，哮喘組ERK1、ERK2的mRNA水平表達(dá)量顯著高于正常組(P＜0.05)，且隨OVA霧化時間的延長其表達(dá)量也逐漸增加，與CyclinD1mR

7、NA水平表達(dá)相一致。 4、構(gòu)建哮喘小鼠模型，并應(yīng)用孟魯司特鈉進(jìn)行干預(yù)治療。治療組每次霧化吸入OVA前30min予以孟魯司特鈉(10mg/kg)灌胃給藥。免疫組化結(jié)果顯示CyclinD1在哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中皆有表達(dá)而在對照組中表達(dá)較弱(P＜0.05)，治療組表達(dá)量低于哮喘組(P＜0.05)；RT-PCR及Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)CyclinD1在哮喘組表達(dá)量較對照組為高(P＜0.01)，而治療組表