茶多酚在大鼠的多組分藥代動力學和抗自由基藥效動力學及其相關(guān)性研究.pdf

1、目的：1）建立靈敏且高度特異的LC-MS/MS法同時測定大鼠血漿中茶多酚(Tea polyphenols，TP)的4種兒茶素類抗氧活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素(EGC)和表兒茶素(EC)，從而研究TP在大鼠體內(nèi)的多組分藥代動力學。2）采用血清藥理學方法，研究TP的抗自由基藥效動力學。3）分析TP的多效應(yīng)成分整合藥代動力學與藥效動力學(PK/PD)相關(guān)性。
　　 方法：

2、血漿樣品經(jīng)乙酸乙酯液-液萃取；采用ESI離子源，多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)，負離子掃描，測定EGCG、ECG、EGC和EC的血藥濃度；用于定量分析的檢測離子分別為m/z457.0→168.8(EGCG)，m/z441.0→168.8(ECG),m/z305.1→124.8(EGC),m/z289.1→108.8(EC),m/z150.9→135.8(內(nèi)標，香草醛)。色譜柱為HypersilODSC18柱(2.1mm×150mm，5μm)，

3、流動相為甲醇-水(30:70)，等度洗脫，流速：0.5mL·min-1:以香草醛為內(nèi)標，采用峰面積內(nèi)標法定量。大鼠單劑靜脈注射(iv)和口服(po)TP及單組分EGCG不同時間收集血漿樣品，測定血藥濃度；ⅳ所得C-T曲線由3p97程序擬合房室模型，計算有關(guān)藥動學參數(shù)：po給藥后的C-T曲線按非房室模型方法求算有關(guān)藥動學參數(shù)，評價po生物利用度。比較單組分給藥及多組分給藥時EGCG藥動學的異同。制備膽瘺大鼠模型，以探討po TP后C-T曲

4、線雙峰現(xiàn)象是否與腸肝循環(huán)(EHC)有關(guān)，并計算EHC分數(shù)。應(yīng)用血清藥理學方法研究TP的抗自由基作用及其動力學；以Fenton反應(yīng)建立小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化體外模型，采用大鼠給藥后不同時間采集的含藥血清對體外小鼠肝勻漿脂質(zhì)過氧化的抑制率考察TP抗自由基效應(yīng)，將效應(yīng)(E)對時間(T)作圖得E-T曲線，計算有關(guān)藥效動力學參數(shù)。根據(jù)各成分在4種成分總AUC中所占比值自定義各成分在整合濃度中各自的權(quán)重系數(shù)，求算TP的整合濃度(Cint)，繪制Cin

5、t-T曲線，進一步進行多效應(yīng)成分整合藥動學的研究。以藥效（脂質(zhì)過氧化抑制率）對logCint作圖，線性回歸，以相關(guān)系數(shù)r表示E-logCint的相關(guān)性，同時以E與各兒茶素類成分的血藥濃度對數(shù)(log Cj)作圖，線性回歸所得相關(guān)系數(shù)r進行比較。
　　 結(jié)果：EGCG、ECG、EGC、EC和IS的保留時間分別為1.70、3.53、1.18、2.29和2.86min，各物質(zhì)之間達到基線分離。4種兒茶素類成分的標準曲線的線性范圍分別為

6、10～10000ng·mL-1(EGCG)和5～5000ng·mL-1（ECG、EGC和EC）(r＞0.9966)。QC樣品的日內(nèi)和日間精密度RSD均小于10％:準確度均在90%～110%;EGCG、ECG、EGC、EC及IS的血漿樣品萃取回收率均大于72%，且基質(zhì)效應(yīng)在88%～106%。血漿樣品室溫保存至少8h內(nèi)穩(wěn)定，-20℃保存至少一個月內(nèi)穩(wěn)定，血漿樣品經(jīng)EtoAc萃取后2～4℃保存至少24h內(nèi)穩(wěn)定。靜脈注射(iv)TP50mg·k

7、g-1和100mg·kg-1后4種兒茶素類主要活性成分的血漿藥代動力學均符合三室模型，EGCG、ECG、EC和EGC的消除半衰期t1/2γ分別為651～705min、605～621min、144～159min和101～104min，4種組分的Vd分別為24～28L·kg-1、16～17L·kg-1、4.2～7.8L·kg-1和7.1～7.3L·kg-1，CL分別為0.026～0.029L·min-1·kg-1、0.018～0.019L·

8、min-1·kg-1、0027～0.038L·min-1·kg-1和0.041～0.046L·min-1·kg-1;口服TP50mg·kg-1和100mg·kg-1后上述4種組分按血管外給藥非房室模型分析，其C-T曲線呈雙峰或多峰現(xiàn)象，但膽瘺大鼠無此現(xiàn)象，提示TP口服C-T曲線的雙峰或多峰現(xiàn)象與EHC有關(guān)，計算得EHC分數(shù)為6.1%～21.8%。由AUC估算，EGCG、ECG、EC和EGC平均生物利用度(F)分別為3.29～9.93%、

9、3.27～8.85%、6.58～8.07%和9.24～14.3%。EGCG單組分iv給予TP50mg/kg，其t1/2為422min，Vd為25L·kg-1，CL為0.041min-1·kg-1，po生物利用度為1.34%。E-T曲線顯示ivTP后抗自由基作用的衰減分為三個先快后慢的不同時相，其t1/2α，E、t1/2β，E、t1/2γ,E和AUE分別為9.86min、80.08min、688.43min和42103。整合藥動學與藥效動

10、力學高度正相關(guān)，其E-logCint作圖為一直線，線性回歸后得相關(guān)系數(shù)r2為0.9978(iv50mg·kg-1)和0.9962(iv100mg·kg-1)，大于效應(yīng)與單組分ECG、EGC和EC血藥濃度對數(shù)作圖（E-logCj圖）所得相關(guān)系數(shù)，而與主要活性成分ECG所得相關(guān)系數(shù)一致。
　　 結(jié)論：本文建立的LC-MS/MS法同時測定大鼠血漿中TP主要活性成分EGCG、ECG、EGC和EC的濃度，經(jīng)方法學驗證表明特異性和靈敏度高、

11、精密度好、回收率高，且基質(zhì)效應(yīng)可以忽略。藥代動力學參數(shù)顯示，TP在大鼠體內(nèi)分布快速，自深室的消除較慢；分布廣泛，遠大于總體水；4種兒茶素成分口服吸收迅速，但生物利用度較低，均＜10%，4種兒茶素類化合物中酯型兒茶素類（EGCG和ECG）的動力學與非酯型兒茶素類（EGC和EC）的動力學存在明顯差別，前者t1/2、Vd大于后者，但CL則小于后者。TP給藥的多組分藥動學與EGCG單組分給藥的藥動學進行比較，前者t1/2長，po生物利用度高，說

12、明TP中EGCG在多組分給藥時受到其他成分的影響，多組分給藥與單組分給藥有著不同的動力學行為。以血清藥理學方法研究TP抗自由基藥效動力學，將其效應(yīng)指標（脂質(zhì)過氧化抑制率）和時間代入3p97程序進行房室模型擬合，發(fā)現(xiàn)TP的藥效動力學符合三室模型，其動力學參數(shù)顯示，TP在本研究所用的劑量范圍內(nèi)藥效學呈線性。ivTP50mg·kg-1和100mg·kg-1后的整合藥代動力學符合三室模型，并且與藥效動力學行為相吻合。多效應(yīng)成分整合藥代動力學較單