LOX在百草枯致肺纖維化過程中上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用.pdf

1、百草枯（Paraquat，PQ）中毒是發(fā)展中國家急性中毒患者死亡的主要原因。肺是其主要靶器官，PQ中毒后，迅速在肺內(nèi)積聚，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞滲透性增加，肺出血、水腫，引起急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合癥，進(jìn)一步發(fā)展為肺纖維化，肺纖維化是 PQ中毒導(dǎo)致死亡的主要原因。PQ中毒沒有特殊解毒藥物，因此研究百草枯導(dǎo)致的肺纖維化的機(jī)制具有重要意義。
　　肺纖維化的主要病理特征是肺泡結(jié)構(gòu)破壞，功能喪失，成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積

2、(extracellular matrix，ECM)。在肺纖維化的過程中，分泌細(xì)胞外基質(zhì)的主要是肌成纖維細(xì)胞。肌成纖維細(xì)胞主要有3個(gè)來源，間質(zhì)內(nèi)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞；骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞；肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）。研究表明EMT是肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞的重要來源，目前大量的實(shí)驗(yàn)關(guān)注EMT在纖維化疾病中的研究。在ECM的沉積中起重要作用的是

3、賴氨酰氧化酶（Lysyl oxidase，LOX），LOX是一種銅依賴性氨基酸氧化酶，通過催化細(xì)胞外的膠原蛋白和彈性蛋白特定位置的賴氨酰殘基氧化脫氨，引起分子內(nèi)和分子間的共價(jià)交聯(lián)，從而形成穩(wěn)定的不溶性的ECM，在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。另外，大量的研究越來越重視LOX在細(xì)胞內(nèi)的功能并提出LOX可能在EMT過程中發(fā)揮作用。我們之前的研究表明EMT在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化中發(fā)揮重要作用，因此我們推斷LOX是否在PQ導(dǎo)致的肺纖維化的EM T中發(fā)揮

4、作用。論文主要探討LO X在PQ中毒后導(dǎo)致的肺纖維化過程中與EMT的關(guān)系。本課題進(jìn)行了以下研究：
　　1．觀察百草枯中毒后LOX表達(dá)、肺纖維化及EMT的情況
　　(1)制備PQ中毒大鼠模型，蘇木素-伊紅(HE)和M asso n染色評(píng)估肺組織病理學(xué)改變；免疫組化和Western Blot檢測(cè)肺組織中LOX蛋白表達(dá)；Western Blot檢測(cè)肺組織中EMT上皮標(biāo)志蛋白 ZO-1、E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志α-SMA、Vi

5、mentin蛋白表達(dá)。
　　(2)制備PQ中毒體外模型，采用不同濃度的PQ處理RLE-6TN和A549細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞形態(tài)變化；采用Western Blot檢測(cè)細(xì)胞上皮和間質(zhì)蛋白表達(dá)變化。
　　2. LOX在百草枯致肺纖維化過程中EMT的作用
　　(1)制備PQ中毒大鼠模型，采用LOX抑制劑BAPN腹腔內(nèi)注射處理動(dòng)物后PQ染毒；蘇木素-伊紅(HE)和Masson染色評(píng)估肺組織病理學(xué)改變；免疫組化和Western

6、Blot檢測(cè)肺組織中LOX蛋白表達(dá)；Western Blot檢測(cè)肺組織中上皮標(biāo)志物、間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。
　　(2)制備PQ中毒體外模型，采用LOX抑制劑BAPN處理細(xì)胞后再PQ染毒；觀察細(xì)胞形態(tài)；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中LOX、上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。
　　(3)制備PQ中毒體外模型，體外采用LOX基因沉默（siRNA）沉默LOX基因再進(jìn)行PQ處理；觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中LOX

7、表達(dá)；Western Blot和免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中上皮標(biāo)志物和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1. HE和Masson染色顯示PQ染毒72 h后大鼠肺內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維沉積；免疫組化和Western Blot結(jié)果顯示大鼠染毒72 h后肺組織內(nèi)LOX增高；EMT上皮標(biāo)志蛋白ZO-1和E-cadherin在大鼠中毒72 h后表達(dá)減少，間質(zhì)標(biāo)志α-SMA和Vimentin蛋白表達(dá)增強(qiáng)。這一結(jié)果提示PQ中毒

8、后大鼠肺纖維化早期即發(fā)生，并伴隨LOX表達(dá)升高及EMT的發(fā)生。
　　2.獲得PQ誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的體外模型，PQ對(duì)細(xì)胞存活率的影響具有濃度依賴性，RLE-6 TN細(xì)胞在PQ濃度為80μmo l/L時(shí)存活率為47.88％，A549細(xì)胞在PQ濃度800umo l/L時(shí)生存率為54.96%，我們以此濃度建立RLE-6TN和A549細(xì)胞PQ中毒的模型。
　　3. PQ處理A549和RLE-6TN細(xì)胞24 h后，細(xì)胞由圓形或卵圓形變成

9、長梭形，LOX蛋白表達(dá)增加，EMT的上皮標(biāo)志E-cadherin和ZO-1表達(dá)降低，間質(zhì)標(biāo)志α-SMA和Vimentin表達(dá)升高，細(xì)胞發(fā)生了EMT。
　　5.應(yīng)用LOX的抑制劑BAPN抑制RLE-6TN和A549細(xì)胞LOX蛋白活性，再進(jìn)行PQ處理，EMT的程度減弱；且減弱程度隨抑制劑的濃度增加而增強(qiáng)。
　　6. siRNA沉默A549細(xì)胞LOX基因后，再進(jìn)行PQ處理24 h，發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞EMT的程度被減弱。
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10、.單純用抑制劑BAPN處理RLE-6TN和A549細(xì)胞和大鼠肺組織后，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)生變化，但EMT標(biāo)志蛋白ZO-1和E-cadherin升高，間質(zhì)標(biāo)志α-SMA和Vimentin水平降低，類似于細(xì)胞發(fā)生了“間質(zhì)向上皮的轉(zhuǎn)化（mesenchymal-to-epithelial transition，MET）”
　　基于以上結(jié)果我們推測(cè)，在PQ誘導(dǎo)的肺纖維化過程中，LOX的表達(dá)可以促進(jìn)EMT的進(jìn)展，抑制LOX的活性，EMT的程度被減