小分子化合物Me6促進(jìn)造血及小腸干-祖細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、核恐怖襲擊、突發(fā)核電站泄漏事故或核戰(zhàn)爭條件等都極有可能導(dǎo)致人群出現(xiàn)急性放射?。c型、骨髓型等）甚至死亡。電離輻射可以損傷全身多種組織，但在一定劑量水平上，由于組織細(xì)胞的輻射敏感性不同，各器官的反應(yīng)程度也不同，其中造血組織和腸組織對輻射較為敏感，輻射會(huì)導(dǎo)致造血系統(tǒng)和胃腸系統(tǒng)的損傷。飛速發(fā)展的核技術(shù)在醫(yī)療領(lǐng)域也得到了很好的應(yīng)用，如放射治療技術(shù)已經(jīng)成為治療惡性腫瘤的重要手段之一。放療技術(shù)雖然能夠針對特定腫瘤部位進(jìn)行殺傷，但是，該技術(shù)的應(yīng)用仍然

2、會(huì)產(chǎn)生副作用——造成正常組織的損傷，如放射性腸損傷等，這些副作用的產(chǎn)生也極大地限制了放療有效劑量的使用。如何促進(jìn)輻射損傷組織的修復(fù)仍是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。近年來的研究表明干細(xì)胞是組織損傷修復(fù)的理想種子細(xì)胞。干細(xì)胞本身具有極強(qiáng)自我更新能力和定向分化潛能，此外還具有向損傷組織遷移、分化成子代細(xì)胞，分泌細(xì)胞因子等能力。因此，我們可以在體外調(diào)節(jié)干細(xì)胞的擴(kuò)增或定向分化，或調(diào)節(jié)體內(nèi)干細(xì)胞的活性等，使其更好地發(fā)揮種子細(xì)胞的作用，從而加快輻射損傷組織的修復(fù)

3、。
　　我所在課題組前期通過小鼠模型對一系列小分子化合物進(jìn)行骨髓干/祖細(xì)胞調(diào)節(jié)（動(dòng)員、募集）能力的篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種新型的小分子化合物即三（2-二甲氨基乙基）胺（Me6TREN,縮寫為Me6），這種小分子化合物經(jīng)單次皮下給藥后可以快速、有效地將骨髓中的造血干/祖細(xì)胞動(dòng)員至外周血中，將這些動(dòng)員的造血干細(xì)胞移植入輻射損傷的小鼠體內(nèi)，可以加快其造血系統(tǒng)的恢復(fù)。Me6對造血干細(xì)胞動(dòng)員的機(jī)制是什么？是否與造血干細(xì)胞的增殖有關(guān)呢？為了弄清這一

4、問題，我們開展了如下實(shí)驗(yàn)：
　　首先，將正常小鼠隨機(jī)分為對照組（Con組）和Me6組（皮下注射Me6，劑量為5 mg/kg），12小時(shí)后，分離兩組小鼠的骨髓細(xì)胞，利用集落形成實(shí)驗(yàn)及流式分析等方法觀察Me6對小鼠骨髓細(xì)胞中造血干/祖細(xì)胞數(shù)量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Me6組小鼠骨髓細(xì)胞中集落形成單位（Colony-forming unit，CFU）的數(shù)量和高增殖潛能集落形成單位（High-proliferative-potential CF

5、U，HPP-CFU）的數(shù)量明顯增加，約為Con組的1.2倍和1.3倍；Me6組小鼠骨髓細(xì)胞中造血干/祖細(xì)胞表面標(biāo)志Lin-Sca-1+c-Kit+（LSK）的比例明顯增加，約為Con組的1.7倍。這說明Me6能促進(jìn)小鼠骨髓中造血干/祖細(xì)胞的增殖。
　　我們進(jìn)一步在體外觀察Me6是否具有促進(jìn)造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的能力。在體外分離小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，分為Con組和Me6組（在培養(yǎng)體系中加入Me6，濃度為100μM）進(jìn)行培養(yǎng)。4天后，對細(xì)

6、胞數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)比較，對細(xì)胞中造血祖細(xì)胞的集落形成能力進(jìn)行檢測，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測造血干/祖細(xì)胞LSK中Ki-67+的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Me6組細(xì)胞中總CFU的數(shù)量和HPP-CFU的數(shù)量明顯增加，約為Con組的1.4倍和1.3倍；Me6組造血干/祖細(xì)胞中Ki-67+的比例也顯著增加，約為Con組的1.5倍。這些結(jié)果提示Me6具有促進(jìn)正常造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增的能力。
　　為進(jìn)一步明確小分子化合物Me6是否能促進(jìn)輻射損傷造血細(xì)胞的擴(kuò)增，我們

7、分離了小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，對其進(jìn)行3 Gy照射，建立輻射損傷細(xì)胞模型。將輻照細(xì)胞分為Con組和Me6組（在培養(yǎng)體系中加入Me6，濃度為100μM）對其進(jìn)行培養(yǎng)，7天后收集細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞中Ki-67+的比例進(jìn)行檢測，考察Me6對細(xì)胞增殖能力的影響。并通過脾結(jié)節(jié)形成實(shí)驗(yàn)（Spleen colony-forming units at day12，CFU-S12），來考察Me6對細(xì)胞中造血干/祖細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Me6組

8、Ki-67+細(xì)胞的比例明顯增多，約為Con的1.5倍。Me6組CFU-S12的數(shù)量明顯增多，約為Con的2.2倍。這說明Me6能促進(jìn)輻射傷造血細(xì)胞的增殖，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持該小分子化合物具有促進(jìn)輻射損傷造血系統(tǒng)修復(fù)的能力。
　　課題組的前期工作顯示，小分子化合物Me6可提高輻射損傷小鼠的生存率，對輻射損傷的小腸組織也表現(xiàn)出促修復(fù)的作用。小腸干細(xì)胞與造血干/祖細(xì)胞雖然起源不同，但是卻受到一些相似的信號通路的調(diào)節(jié)，如Wnt、Notch

9、通路等。輻射損傷小腸組織的修復(fù)是否與Me6對小腸干細(xì)胞的調(diào)控相關(guān)？我們首先用X-射線對IEC-6細(xì)胞（大鼠小腸上皮細(xì)胞，具有未分化的小腸上皮隱窩細(xì)胞的特征）進(jìn)行5Gy照射，建立了輻射損傷的IEC-6細(xì)胞模型。通過CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)檢測BrdU摻入、克隆形成等方法，觀察了Me6對輻射損傷IEC-6細(xì)胞增殖能力的影響。同時(shí)也通過AnnexinV/PI染色法，檢測了細(xì)胞凋亡的情況。結(jié)果表明，Me6可以抑制輻射損傷腸上皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增

10、殖；Me6處理后BrdU摻入的比例顯著提高，約為Con組的1.5倍；該化合物可以使輻射損傷IEC-6細(xì)胞所形成的克隆數(shù)明顯增多，約為Con組的2.6倍。這些結(jié)果提示Me6可能促進(jìn)小腸干細(xì)胞的增殖。
　　為進(jìn)一步確定小分子化合物是否能促進(jìn)小腸干細(xì)胞的增殖，我們在體外分離了小鼠小腸隱窩細(xì)胞。有文獻(xiàn)表明，體外分離的小腸隱窩細(xì)胞中含有小腸干細(xì)胞，通過建立三維的培養(yǎng)體系（在Matrigel中進(jìn)行培養(yǎng)，加入培養(yǎng)基和所需的細(xì)胞因子），可以實(shí)現(xiàn)在

11、體外對小腸干細(xì)胞的培養(yǎng)。隱窩細(xì)胞的出芽代表著小腸干細(xì)胞的增殖能力，因此我們可以通過出芽的數(shù)量對小腸干細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行評估。我們向小腸隱窩細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加Me6，觀察隱窩細(xì)胞出芽的數(shù)量，并進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測隱窩中Lgr5+細(xì)胞的比例。結(jié)果表明，Me6促進(jìn)了隱窩細(xì)胞出芽小體的形成，增加了隱窩細(xì)胞出芽的數(shù)量，約為Con組的2.5倍；增加了隱窩細(xì)胞中Lgr5+小腸干細(xì)胞的比例，約為Con組的2.3倍。為探究小分子化合物Me6是否調(diào)節(jié)小

12、腸干細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測隱窩細(xì)胞中一些基因的表達(dá)，檢測結(jié)果表明，Me6增加了隱窩細(xì)胞中CyclinD1、Myc、Jun等增殖相關(guān)基因的表達(dá)，增加了Lgr5、Olfm4、Ascl2、Bmi1等小腸干細(xì)胞的相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)減少了P53、Puma、Bax凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。這些結(jié)果說明Me6促進(jìn)小鼠小腸干細(xì)胞的增殖，并減少其凋亡。
　　為了探索Me6促進(jìn)小腸干細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，我們對小鼠小腸隱窩細(xì)胞

13、進(jìn)行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞差異表達(dá)基因中，Me6組β-catenin調(diào)控的靶基因被明顯上調(diào)表達(dá)，在這些靶基因中有一部分是小腸干細(xì)胞相關(guān)調(diào)控基因，這提示我們Me6可能是通過激活β-catenin發(fā)揮促進(jìn)小鼠小腸隱窩細(xì)胞增殖的作用。我們進(jìn)一步通過Western blot驗(yàn)證β-catenin蛋白在IEC-6和隱窩細(xì)胞中的磷酸化表達(dá)情況，并通過對IEC-6細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA，檢測Me6對IEC-6細(xì)胞促增殖作用是否