中醫(yī)氣虛血虛模型與造血干-祖細(xì)胞衰老.pdf

1、目的
　　隨著世界和我國人口老齡化進(jìn)程的加快、人口壽命的延長，衰老與延緩衰老的研究已成為生命科學(xué)和社會科學(xué)共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題。生長、發(fā)育、衰老與死亡是不可避免的生命自然規(guī)律，但防治病理性衰老是可以實(shí)現(xiàn)的。最新研究認(rèn)為，機(jī)體干細(xì)胞的衰老是生物體衰老的關(guān)鍵原因，因此，探討延緩干細(xì)胞衰老方法和調(diào)控衰老干細(xì)胞靶向分化對闡述衰老的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)理與防治老年性疾病有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。造血干細(xì)胞(HSC)是最受關(guān)注的成體干細(xì)胞，它具有自我

2、更新和多向分化潛能，是所有血細(xì)胞的始祖細(xì)胞，在特點(diǎn)條件下還可形成某些非造血細(xì)胞。目前研究證明，HSC衰老與生物體的衰老和多種老年性疾病密切相關(guān)。由此可見，研究HSC衰老的生物學(xué)特性，尋找延緩其衰老途徑已經(jīng)成為干細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱門課題。
　　“氣虛血虛”是中醫(yī)臨床常見的基礎(chǔ)病癥，構(gòu)建“氣虛血虛”模型是研究其現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)理的基礎(chǔ)。在臨床上氣虛往往表現(xiàn)為免疫功能低下，而免疫細(xì)胞的功能缺陷是導(dǎo)致免疫系統(tǒng)功能低下的關(guān)鍵因素。免疫細(xì)胞起源造血

3、干細(xì)胞，推測造血干細(xì)胞衰老或功能低下是氣虛癥的本質(zhì)所在。中醫(yī)臨床的血虛與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的貧血相似，認(rèn)為血細(xì)胞生成、釋放和丟失失調(diào)所致的貧血是血虛的本質(zhì)所在。由此可見，中醫(yī)的氣虛血虛與造血干細(xì)胞功能都有密切關(guān)系，迄今還未見從造血干細(xì)胞角度研究氣虛血虛機(jī)理的報(bào)道。本課題采用X射線全身照射(TBI)和鹽酸苯肼注射建立小鼠骨髓抑制和貧血模型，探討中醫(yī)“氣虛血虛”的現(xiàn)代生物學(xué)機(jī)理，并重點(diǎn)研究造血干細(xì)胞衰老與“氣虛血虛”的生物學(xué)關(guān)系，為尋找延緩造血干細(xì)胞

4、衰老的方法提供理論指導(dǎo)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法
　　1氣虛血虛模型構(gòu)建：模型組，小鼠全身一次性X線照射，劑量為6.5GY，6h后腹腔注射40mg/Kg鹽酸苯肼；對照組：僅作假照射，同時(shí)間注射等量生理鹽水，兩組小鼠實(shí)驗(yàn)前后均常規(guī)飼養(yǎng)。
　　2氣虛血虛模型小鼠相關(guān)指標(biāo)檢測：模型構(gòu)建第3、7、14、28天，分別觀察模型組與對照組小鼠的行為表現(xiàn)；采集外周血，檢測外周血象；頸椎脫臼處死小鼠，取殷骨并計(jì)算骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)、造血干細(xì)胞

5、數(shù)，取脾測定脾指數(shù)、脾臟病理切片觀察形態(tài)學(xué)。
　　3 Sca-1+HSC/HPC分離、純化與鑒定：免疫磁珠磁性分選法(MACS)分離、純化Sea-1+HSC/HPC，流式細(xì)胞術(shù)檢測分選細(xì)胞百分率、免疫熒光染色鑒定細(xì)胞性質(zhì)，臺酚藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性。
　　4細(xì)胞衰老生物學(xué)檢測：衰老相關(guān)p-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色、混合性造血祖細(xì)胞集落(CFU-Mix)培養(yǎng)、細(xì)胞周期測定評價(jià)干細(xì)胞的生物學(xué)衰老特征。
　　5衰老基因

6、檢測：PCR檢測與衰老相關(guān)的基因，包括p16INK4a，p53。
　　結(jié)果
　　1模型組小鼠在各時(shí)間點(diǎn)上均表現(xiàn)出精神萎靡、行為遲緩，進(jìn)食減少，駝背倦怠和毛色失潤等，符合中醫(yī)“氣虛血虛”病癥。外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板數(shù)顯著降低，紅細(xì)胞和血紅蛋白水平在第7d下降至最低點(diǎn)，第28d各指標(biāo)仍沒有完全恢復(fù)至正常水平。骨髓單個(gè)核細(xì)胞即刻降低，第3d降到了最低點(diǎn)，第7d逐漸緩慢恢復(fù)，14d恢復(fù)至對照組水平的50％，第28d恢

7、復(fù)到對照組的65.7％；Sca-1+HSC在第3d急劇下降，在第7d恢復(fù)緩慢。14d恢復(fù)至對照組的14.5％，第28天恢復(fù)到21.3％。脾指數(shù)均明顯降低，脾臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)退行性變化。
　　2 MACS分選前，骨髓單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)中的Sca-1+細(xì)胞百分比為1.8±1.2％；MACS分離純化后，Sca-1+細(xì)胞百分比可達(dá)87.33±1.25％。分選前MNCs中極少細(xì)胞表達(dá)Sca-1+陽性，分離純化后的標(biāo)記細(xì)胞中有大量的細(xì)胞表達(dá)

8、Sca-1+；分選的Sca-1+HSC/HPC活性為96％～99％。
　　3模型組小鼠Sca-1+HSC/HPC的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色百分率顯著增加；混合性造血祖細(xì)胞集落(CFU-Mix)形成數(shù)減少，集落細(xì)胞數(shù)少：HSC細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，其G0/G1期比例明顯增高，S期比例減少，其中第3-7d細(xì)胞周期在G1期的阻滯最為嚴(yán)重，第28d后逐漸恢復(fù)并接近對照組水平。
　　4模型組中小鼠衰老相關(guān)基因灰度值p16I