Oct4聯(lián)合小分子化合物誘導(dǎo)肝細(xì)胞重編程為胰腺干祖樣細(xì)胞.pdf

1、目的:
　　1、探討在Oct4介導(dǎo)下小鼠原代肝細(xì)胞發(fā)生去分化的細(xì)胞形態(tài)及基因表達(dá)的變化趨勢,探索肝細(xì)胞去分化后向胰腺干祖樣細(xì)胞誘導(dǎo)的合適時機(jī)。
　　2、應(yīng)用小分子化合物將去分化的肝細(xì)胞誘導(dǎo)為胰腺干祖樣細(xì)胞。
　　方法:
　　第一部分:分離培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞,構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pWPT-Oct4,包裝表達(dá)Oct4的慢病毒,將其感染原代肝細(xì)胞,觀察細(xì)胞的形態(tài)變化,用RT-PCR法監(jiān)測nestin、ALB、AFP以及F

2、oxa2的表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。用RT-PCR法監(jiān)測“中間狀態(tài)細(xì)胞”標(biāo)志物:SOX17,HNF6,HNF1β,SOX9的表達(dá)趨勢,結(jié)合細(xì)胞形態(tài)的變化,探索肝細(xì)胞去分化后向胰腺干祖樣細(xì)胞誘導(dǎo)的合適時機(jī)。
　　第二部分:根據(jù)SOX9的表達(dá),聯(lián)合應(yīng)用小分子化合物:表皮生長因子(EGF),堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF),Exendin-4等對去分化后的肝細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),觀察細(xì)胞形態(tài),用RT-PCR及免疫熒光染色法檢測胰腺干細(xì)胞標(biāo)志物CK

3、19、ABCG2的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　第一部分:感染Oct4-慢病毒后,原代肝細(xì)胞胞內(nèi)顆粒逐漸釋放出來,在第7天時細(xì)胞的增殖能力有所增強(qiáng)。RT-PCR結(jié)果顯示,感染Oct4-慢病毒后,成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志物ALB表達(dá)減弱,不成熟肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、Foxa2表達(dá)增強(qiáng),表明肝細(xì)胞發(fā)生去分化,細(xì)胞成熟表型逐漸丟失。在此過程中,多譜系前體細(xì)胞標(biāo)志物nestin表達(dá)逐漸增強(qiáng),從第3天持續(xù)至第9天,從第12天起開始減弱。在感染Oct4

4、-慢病毒后第2天可檢測到HNF1β,HNF6的表達(dá),第6天可檢測到SOX9的表達(dá)。
　　第二部分:在SOX9開始表達(dá)的第6天起,用小分子化合物誘導(dǎo)去分化的肝細(xì)胞生成胰腺干祖樣細(xì)胞,在誘導(dǎo)4天后細(xì)胞呈集落樣生長,可檢測到胰腺干細(xì)胞標(biāo)志物CK19、ABCG2的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　在基因Oct4及小分子化合物聯(lián)合誘導(dǎo)下,肝細(xì)胞經(jīng)去分化可進(jìn)一步向胰腺譜系誘導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)探索了體外產(chǎn)生胰腺干細(xì)胞的新途徑,為擴(kuò)大胰島移植的來源和實(shí)