Klotho蛋白干預腎臟纖維化的機制研究.pdf

1、背景:
　　1997年，一個科學小組意外獲得一種基因變異的小鼠。這種小鼠的表型同人類衰老表型很相似，因此將這一小鼠以希臘神話中主管生命長度的女神klotho命名。klotho變異純合子(kl/kl)小鼠出生三周內(nèi)并沒有表現(xiàn)出與野生型小鼠不同的表型。出生三周以后表現(xiàn)為明顯的發(fā)育停滯，嚴重的血管壁鈣化，皮下脂肪萎縮，肺氣腫，骨質(zhì)疏松，缺少發(fā)育成熟的生殖系統(tǒng)，壽命縮短等酷似人類衰老現(xiàn)象的表型。腎臟是Klotho蛋白的主要表達場所，大腦脈

2、絡叢也少量表達Klotho蛋白。Klotho蛋白有兩種存在形式。一種是單次跨膜蛋白，作為FGF23受體的共同受體而發(fā)揮作用。FGF23屬于Fibroblast Growth Factor家族，主要來源于骨組織。在腎近曲小管上皮細胞表面存在FGF23的受體。在Klotho存在的條件在，F(xiàn)GF23特異性的和它的受體結(jié)合，激活下游信號通路，抑制原尿中磷的重吸收，從而維持血液循環(huán)中磷的生理濃度。FGF23與受體結(jié)合后還可以抑制合成活性維生素D的

3、關(guān)鍵酶Cyp27b1，從而抑制活性維生素D的合成。因此，同F(xiàn)GF23-deficient小鼠相似，kl/kl小鼠也表現(xiàn)為高血磷和高血活性維生素D。Klotho蛋白的另一種存在形式是作為一種分泌蛋白。與細胞膜結(jié)合的Klotho在一些膜錨定蛋白酶，比如ADAM10、ADAM17或者BACE1，的水解作用下，將自身膜外部分解離并釋放到血液，尿液或者腦脊液中，作為游離的體液網(wǎng)子參與到各種病理生理現(xiàn)象中。
　　腎間質(zhì)纖維化（Renal tu

4、bulointerstitial fibrosis，RTF）是各種慢性腎臟疾病(CKD)的最終病理表現(xiàn)。主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(ECM)累積，成纖維母細胞的激活并伴隨著有功能腎單位的減少。小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎(unilateral ureteralobstruction，UUO)是人CKD的動物模型。UUO施術(shù)后，尿液淤積在腎盂內(nèi)，壓迫導致腎小管擴張，管型形成，炎細胞浸潤，局部炎性因子表達升高，腎小管間質(zhì)纖維化等，很好的模擬了人類慢性腎臟病

5、的局部腎臟表現(xiàn)，是研究人類CKD的理想動物模型。近幾年的研究表明Klotho蛋白在RTF發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。比如Klotho在CKD病人的腎臟中表達下調(diào)，并且它的下調(diào)水平同疾病的嚴重程度成正相關(guān)。在kl/kl小鼠腎臟中，炎性因子和纖維化標記性因子表達均上調(diào)。 UUO術(shù)后，klotho變異雜合子(kl/+)小鼠較野生型小鼠腎臟纖維化和各種炎性因子上調(diào)程度更為嚴重。另有很多報道，外源性Klotho蛋白能夠顯著緩解各種原因?qū)е碌哪I臟損傷

6、。因此，現(xiàn)有的研究都支持Klotho蛋白是一種腎臟保護蛋白。
　　Klotho蛋白被認為能夠拮抗UUO術(shù)后TGF-β信號通路和Wnt/β-catenin信號通路的激活，從而緩解UUO導致的RTF。已有的報道都是利用kl/+小鼠和野生型小鼠UUO術(shù)后對于RTF的比較，很好的支持了這一結(jié)論。然而不同于野生型和kl/+小鼠，kl/kl小鼠具有完全不同的表型，其中循環(huán)中顯著升高的磷，活性維生素D3和FGF23濃度是最為典型的特征，也就是說

7、kl/kl小鼠處于嚴重的內(nèi)環(huán)境紊亂狀態(tài)。有報道指出活性維生素D3和它的異構(gòu)體也是一種腎臟保護因子。比如，在人子宮平滑肌瘤中活性維生素D3能夠抑制TGF-β誘導的纖維化標記的基因表達;活性維生素D3的異構(gòu)體maxacalcito能夠?qū)PM1A/VDR復合體募集到pSmad3上加速后者的去磷酸化。也就是說在kl/kl小鼠中活性維生素D3的升高和Klotho蛋白的不足在RTF發(fā)展中的作用是相反的。至今為止還有沒有高血磷和高血FGF23對于腎

8、臟纖維化影響的報道。因此，kl/kl小鼠UUO施術(shù)后，紊亂的內(nèi)環(huán)境是否會影響腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展，我們不得而知。
　　目的:
　　1.本課題以kl/kl小鼠為模型，研究UUO誘導的腎臟纖維化和Klotho缺失以及內(nèi)環(huán)境紊亂的關(guān)系。
　　2.體外培養(yǎng)原代小鼠腎小管上皮細胞(PTECs)，在單一的環(huán)境下，研究各基因型小鼠腎小管上皮細胞在TGF-beta1刺激后， Smad3磷酸化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標記的基因表達水平。

9、明確高血磷，高血活性維生素D3以及高血FGF23在腎臟纖維化中分別的單獨作用。
　　3.通過飼育特殊飲食扭轉(zhuǎn)kl/kl小鼠表型后檢測正常體液內(nèi)環(huán)境下，UUO施術(shù)誘導的RTF是否發(fā)生改變
　　方法:
　　1.實驗動物:klotho基因沉默雜合子(kl/+)小鼠購買自日本CLEA公司，kl/+交配后獲得子代kl/kl小鼠和野生型小鼠。各組小鼠普通喂養(yǎng)，標準光照及采食。
　　2.腎臟纖維化模型:單側(cè)輸尿管結(jié)扎或者對照組

10、3天或者7天后，處死小鼠，摘取結(jié)扎腎臟或者對照腎臟，分為三等分，分別提取蛋白質(zhì)，mRNA或者福爾馬林固定，制作石蠟切片。
　　3.原代近曲小管上皮細胞培養(yǎng):使不同基因型腎臟上皮細胞處于同樣的培養(yǎng)環(huán)境，排出kl/kl小鼠內(nèi)環(huán)境紊亂對實驗結(jié)果的干擾
　　4.大鼠永生化腎臟上皮細胞系NRK52E按培養(yǎng)條件要求進行培養(yǎng)
　　5.TGF-β1刺激誘導EMT實驗:上述兩種細胞，標準培養(yǎng)條件下，無血清饑餓12小時后，培養(yǎng)基中加入外源

11、性TGF-β1培養(yǎng)12或者24小時。收集細胞檢測EMT指標的表達情況。
　　6.內(nèi)環(huán)境紊亂體外模擬實驗:NRK52E細胞分別在含有2mM，4mM NaH2PO4，外源性FGF23和外源性的活性維生素D3的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)進行培養(yǎng)，以分別模擬體內(nèi)高血磷，高血FGF23和高血活性維生素D3狀態(tài)。
　　7.免疫組織化學或者免疫熒光染色檢測UUO術(shù)后及對照組腎臟纖維化標記αSMA、CollagenⅠ的表達及分布和Smad3磷酸化情況

12、。
　　8.實時熒光定量PCR檢測腎組織α SMA、CollagenⅠ的mRNA水平和體外培養(yǎng)細胞內(nèi)EMT相關(guān)基因（α SMA、CollagenⅠ和E-cadherin）的mRNA水平。
　　9.Western Blot方法檢測TGF-beta1誘導EMT相關(guān)蛋白水平和組織、細胞內(nèi)Smad3磷酸化水平。
　　10.ELISA方法檢測腎臟組織內(nèi)UUO施術(shù)前后TGF-β1的蛋白質(zhì)含量。
　　11.收集血清，檢測活性維

13、生素D3的含量。
　　12.對于同周齡各組基因型小鼠測量體重。
　　13.內(nèi)環(huán)境紊亂挽救實驗:kl/kl小鼠分別飼育正常飼料和不含維生素D3的特制飼料，觀察檢測其表型變化以及UUO術(shù)后腎臟纖維化標記的表達水平。
　　14.采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行Student's t-test檢驗和one-way ANOVA with aStudent-Newman-Keuls test檢驗。
　　結(jié)果:
　　

14、1、UUO術(shù)后各基因型小鼠呈現(xiàn)不同的RTF水平
　　普通飲食6周齡的各基因型小鼠施UUO手術(shù)或者假手術(shù)作為對照。取術(shù)后3天和7天標本，針對RTF指標α SMA、CollagenⅠ進行免疫組織化學染色和qPCR檢測。相較于野生型小鼠，kl/+小鼠αSMA、CollagenⅠ表達明顯上調(diào)(P＜0.05);然而kl/kl小鼠αSMA、CollagenⅠ染色并沒有因為klotho蛋白的完全缺失表現(xiàn)出明顯上調(diào)，相反的，相較于kl/+小鼠α

15、SMA、CollagenⅠ的表達明顯下調(diào)了。在對照組中，WT和kl/+小鼠α SMA、CollagenⅠ染色幾乎是陰性，并且沒有差異，而在kl/kl小鼠中α SMA、CollagenⅠ染色明顯陽性(P＜0.05)。
　　2、kl/kl小鼠結(jié)扎腎臟中TGF-β/Smad3信號通路被抑制了
　　我們在檢測了各基因型小鼠結(jié)扎腎臟和假手術(shù)腎臟TGF-β/Smad3信號通路被激活情況。同RTF表現(xiàn)相一致，kl/+小鼠結(jié)扎腎臟中磷酸化S

16、mad3(pSmad3)的陽性染色和組織內(nèi)蛋白含量均明顯升高，TGF-β1的蛋白和mRNA含量也明顯升高。kl/kl小鼠結(jié)扎腎臟中TGF-β1和pSmad3均被抑制了。而在對照組中，kl/kl小鼠pSmad3陽性染色明顯上調(diào)，可是TGF-β1的蛋白含量卻維持在一個較低的水平上。
　　3、體外原代培養(yǎng)的kl/kl腎小管上皮細胞，TGF-β1誘導的EMT并沒有被抑制
　　各基因型小鼠來源的腎小管上皮細胞進行原代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中

17、加入外源性TGF-β1誘導EMT。與UUO不同，kl/kl細胞EMT指標(α SMA、CollagenⅠ和E-cadherin)和pSmad3并沒有被抑制。相較于wt細胞，kl/kl細胞核kl/+細胞EMT指標均上調(diào)了，并且二者間沒有差異(P＞0.05)。結(jié)果提示kl/kl小鼠UUO后RTF指標的上調(diào)失敗和TGF-β/Smad3信號通路抑制是紊亂的內(nèi)環(huán)境導致的而不是由于Klotho蛋白的完全缺失導致的。
　　4、TGF-β1誘導的

18、EMT可以被1，25(OH)2vitamin D3抑制
　　NRK52E細胞分別在含有高磷酸鹽(2mM，4mM)，高FGF23(0.2μg/ml，2μg/ml)或者高1，25(OH)2 vitamin D3(0.1μg/ml，1μg/ml)的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。添加外源性TGF-β1到上述培養(yǎng)基后，觀測EMT指標變化和Smad3激活情況。只有高1，25(OH)2 vitamin D3劑量依賴性的抑制了TGF-β1誘導的EMT和Sma

19、d3激活。高磷酸鹽和高FGF23沒有產(chǎn)生任何影響。NRK52E細胞單獨培養(yǎng)在高瞵酸鹽的培養(yǎng)基中，即使不加入TGF-β1也表現(xiàn)出一定程度的Smad3激活和EMT相關(guān)基因上調(diào)。
　　5、無維生素D飼料能夠挽救kd/kl小鼠表型，恢復UUO誘導的RTF相關(guān)基因的表達
　　我們將kl/kl小鼠飼育無維生素D飼料，發(fā)現(xiàn)特殊飲食的kl/kl小鼠在表型上同野生型和kl/+沒有區(qū)別。體重和血清活性維生素D3水平都恢復到正常。比較普通飲食和特