藍(lán)莓對大鼠免疫性肝纖維化干預(yù)作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：1.探討藍(lán)莓對大鼠免疫性肝纖維化的作用及肝組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamate-cysteine ligase，γ-GCS)催化亞基（glutamate cysteine ligase catalytic，GCLC）表達(dá)的影響。2.探討藍(lán)莓對免疫性肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated peotein78,GRP78）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(cystein-contai

2、ning aspartate-specific protease12，caspase-12)的影響。3.探討藍(lán)莓對大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞凋亡及Fas、Bcl-2、Bax及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cystein-containing aspartate-specific protease3，caspase-3)表達(dá)的影響。
　　方法：第一部分，60只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組、肝纖維化模型組、藍(lán)莓原漿低、中、

3、高劑量預(yù)防組及復(fù)方鱉甲軟肝片預(yù)防組。除正常對照組外，其余各組均采用豬血清復(fù)制大鼠肝纖維化模型，造模同時各預(yù)防組分別給予藍(lán)莓原漿（0.25ml/100g、0.5ml/100g、1.0ml/100g）及復(fù)方鱉甲軟肝片（0.054g/100g）灌胃，每日一次，共12周。行肝臟HE、Masson染色，透射電鏡下觀察肝組織超微結(jié)構(gòu)變化；計算大鼠肝臟指數(shù)；測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸

4、氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平；檢測肝組織勻漿超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD)、丙二醛（malondialdehyde，MDA)、羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）及GSH含量。實(shí)時熒光定量PCR、蛋白印跡法（western blotting）和免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肝組織GCLCmRNA及蛋白的表達(dá)。
　　第二部分：采用脫氧核糖核酸末

5、端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling，TUNEL）及流式細(xì)胞術(shù)（膜聯(lián)蛋白/碘化丙啶雙標(biāo)記法，Annexin V/PI）檢測上述各組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況；實(shí)時熒光定量PCR、western blotting及免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠肝組織GRP78及Caspase-12 mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　第三部分：采用

6、血清藥理學(xué)方法制備大鼠藍(lán)莓血清、復(fù)方鱉甲軟肝片血清及生理鹽水血清。HSC-T6常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)后，分別加入10％藍(lán)莓低劑量、10%藍(lán)莓中劑量及10%藍(lán)莓高劑量血清干預(yù)，并設(shè)10%復(fù)方鱉甲軟肝片血清作為陽性對照和10%生理鹽水血清對照。Annexin V/PI雙標(biāo)記法檢測各組HSC-T6的凋亡；western blotting檢測各組HSC-T6Fas及Caspase-3的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)及western blotting檢測各組HSC-T

7、6Bax及Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：第一部分，各組大鼠血清 ALT、AST水平無明顯差異；與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯增加（P<0.05）；肝組織勻漿SOD活性、GSH含量明顯下降（P<0.05），MDA及Hyp含量明顯增高（P<0.05）；HE、Masson染色及透射電鏡觀察顯示有明顯肝纖維化（P<0.05）及超微結(jié)構(gòu)病變；肝組織GCLCmRNA和蛋白表達(dá)較正常對照組升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與肝纖維

8、化模型組比較，各預(yù)防組大鼠肝臟指數(shù)明顯減少（P<0.05）；藍(lán)莓原漿中、高劑量及復(fù)方鱉甲軟肝片預(yù)防組大鼠肝組織勻漿SOD活性、GSH含量明顯升高（P<0.05），MDA及 Hyp含量明顯降低（P<0.05）；肝纖維化程度明顯減輕（P<0.05），膠原表達(dá)減少，超微結(jié)構(gòu)病變明顯改善；肝組織GCLC mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）。
　　第二部分：與正常對照組比較，肝纖維化模型組大鼠肝細(xì)胞凋亡明顯增加（P<0.05）；GR

9、P78及Caspase-12 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）。與肝纖維化模型組比較，藍(lán)莓原漿低、中、高劑量預(yù)防組大鼠肝細(xì)胞凋亡有所減少，GRP78及Caspase-12 mRNA和蛋白的表達(dá)有所下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。復(fù)方鱉甲軟肝片預(yù)防組大鼠肝細(xì)胞凋亡明顯減少（P<0.05），GRP78及Caspase-12 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.05）。
　　第三部分：與生理鹽水血清組比較，藍(lán)莓高劑量血清組及復(fù)方鱉甲

10、軟肝片血清組 HSC-T6凋亡明顯增加（P<0.05）；Fas及 Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.05）；復(fù)方鱉甲軟肝片血清組HSC-T6 Bax蛋白表達(dá)明顯增加（P<0.05），藍(lán)莓低、中、高劑量血清組HSC-T6 Bax蛋白表達(dá)無明顯差異；藍(lán)莓高劑量血清組及復(fù)方鱉甲軟肝片血清組HSC-T6 Bcl-2/Bax的比值明顯下降（P<0.05）。
　　結(jié)論：1.藍(lán)莓對免疫性肝纖