熱休克蛋白72抑制腎臟纖維化分子機制的研究.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種慢性腎臟疾病進展到終末期腎衰竭(ESRD)的主要病理基礎(chǔ)和共同途徑，RIF的程度是預測腎臟病慢性進展速度的獨立因素。研究證明，腎間質(zhì)成纖維細胞活化增殖是導致細胞外基質(zhì)(ECM)合成增加和大量積聚的主要原因，在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮極其重要的作用。因此，研究腎間質(zhì)成纖維細胞活化增殖的調(diào)控機制，探索腎臟纖維化的防治措施，有助于延緩慢性腎臟病的進展，為開發(fā)治療腎臟纖維化的新途徑奠定科學依據(jù)。HSP72(HS

2、P72)是一種細胞保護性蛋白，由2個主要的功能結(jié)構(gòu)域參與分子伴侶的作用：C端的多肽結(jié)合區(qū)(PBD)，負責底物的結(jié)合和折疊；核定位序列(NLS)，決定HSP72在應激狀態(tài)下的核聚集。我們前期的研究證明，HSP72可抑制EMT，延緩腎臟纖維化進程。其他學者則發(fā)現(xiàn)，加熱誘導大鼠高表達HSP72能抑制血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)對心房成纖維細胞的激活和延緩心房纖維化。然而，關(guān)于HSP72調(diào)控EMT的分子機制，以及能否直接抑制腎間質(zhì)成纖維細胞的活化和

3、功能，目前尚不清楚。因此，本研究針對以上問題進行了如下探討。
　　 ㈠HSP72調(diào)控EMT的分子機制。
　　 (1)體外研究。
　　 目的：探討HSP72對TGF-β/Smads信號通路的調(diào)控作用，揭示HSP72抑制EMT的分子機制。
　　 方法：10ng/ml TGF-β1刺激腎小管上皮細胞株(NRK-52E)48小時，建立EMT模型。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞和RNA干擾，分別上調(diào)野生型HSP72(Wt-HSP72

4、)或變異型HSP72(HSP72-△PBD和HSP72-△NLS)表達和下調(diào)HSP72表達。以Western印跡檢測E-cadherin，α-SMA的表達和Smad2、磷酸化Smad2(p-Smad2)、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)和Smad7的蛋白含量；間接免疫熒光觀察HSP72和Smad3/p-Smad3的細胞定位；聯(lián)合免疫沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)分析HSP72與Smad3之

5、間的相互作用。
　　 結(jié)果：TGF-β1能誘導NRK-52E細胞的E-cadherin表達下調(diào)和α-SMA表達上調(diào)；特異性高表達HSP72或HSP72-△NLS均可明顯減輕TGF-β1介導的EMT現(xiàn)象，特異性下調(diào)HSP72表達則加重TGF-β1誘導EMT，而HSP72-△PBD不能抑制TGF-β1誘導的EMT。Western-blot結(jié)果顯示，TGF-β1刺激使p-Smad2和p-Smad3呈時間依賴性升高；HSP72或HSP7

6、2-△NLS過表達能明顯降低各時間點p-Smad3的水平，以及細胞核內(nèi)p-Smad3的聚集，而HSP72-△PBD過表達不能阻抑Smad3的活化和核易位。免疫熒光和激光共聚焦結(jié)果進一步證實，HSP72能減少Smad3/p-Smad3在細胞核的聚集。過表達野生型和變異型HSP72均使Smad7蛋白含量增加，但不影響Smad2的磷酸化。Co-IP結(jié)果顯示，HSP72與Smad3/p-Smad3均存在相互作用，而且隨著HSP72的表達增高，H

7、SP72與Smad3的結(jié)合增加；HSP72-△NLS僅在細胞漿與Smad3結(jié)合；HSP72-△PBD則完全不能與Smad3相互作用。
　　 (2)體內(nèi)研究。
　　 目的：探討大鼠UUO模型中HSP72對EMT相關(guān)的Smads蛋白的影響。
　　 方法：雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組(Sham組，開腹不結(jié)扎輸尿管)、單側(cè)輸尿管梗阻模型組(UUO模型組，開腹后結(jié)扎右側(cè)輸尿管)和GGA

8、干預組。每組各6只大鼠。建立模型前1天開始，GGA干預組和模型組分別給予400mg/kg GGA和溶媒(0.05％阿拉伯樹膠+0.008％維生素E)灌胃，每天1次。術(shù)后第7天處死大鼠，并留取右側(cè)腎組織。Western blot和免疫熒光染色檢測HSP72和Smads蛋白的表達。
　　 結(jié)果：Western-blot顯示，UU0模型組腎臟組織p-Smad2和p-Smad3水平明顯升高，Smad7蛋白水平顯著下降；GGA可特異性誘導

9、大鼠腎臟HSP72高表達，抑制p-Smad3，刺激Smad7上調(diào)表達，但不影響p-Smad2的水平。免疫熒光顯示p-Smad3主要分布在腎小管上皮細胞的細胞核內(nèi)，GGA可顯著減少p-Smad3的表達。
　　 小結(jié)：①HSP72可顯著抑制TGF-β1誘導的EMT。②HSP72通過與Smad3/p-Smad3結(jié)合，降低TGF-β1介導的p-Smad3水平，減少p-Smad3的細胞核易位，從而阻止EMT的發(fā)生和發(fā)展。HSP72的PBD

10、功能域是HSP72發(fā)揮上述保護作用的必要分子結(jié)構(gòu)。但是HSP72不影響Smad2的磷酸化。③HSP72穩(wěn)定TGF-β1作用下Smad7的蛋白水平。④GGA可特異性誘導腎臟組織HSP72高表達，顯著抑制UUO模型Smad3磷酸化，并明顯增加Smad7蛋白含量，但對Smad2活化沒有抑制作用。
　　 ㈡HSP72對腎間質(zhì)成纖維細胞活化增殖的影響及其分子機制。
　　 (1)體外研究。
　　 目的：探討HSP72對腎臟成

11、纖維細胞活化增殖和功能異常的影響及機制。
　　 方法：2ng/ml TGF-β1刺激腎間質(zhì)成纖維細胞株(NRK-49F)24小時，誘導其活化和增殖。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和RNA干擾方法分別上調(diào)和下調(diào)細胞HSP72的蛋白水平。以Western印跡檢測α-SMA，F(xiàn)ibronectin，CollagenⅠ和CollagenⅢ的含量。相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變，細胞計數(shù)觀察細胞增殖情況，BrdU吸收率檢測細胞DNA合成情況，MTT檢測細胞活力，

12、流式細胞儀評估細胞凋亡的發(fā)生率，侵襲力實驗分析細胞遷移力。Western blot檢測PCNA，Bcl-xl，Bcl-2，Survivin，Bax蛋白的表達；流式細胞儀檢測細胞周期的分布和變化。Western blot和免疫熒光染色分別檢測Stat3活化情況和細胞內(nèi)分布。Co-IP檢測HSP72與Stat3相互作用。轉(zhuǎn)染含Stat3反應元件的熒光素酶報告質(zhì)粒檢測Stat3轉(zhuǎn)錄活性。
　　 結(jié)果：TGF-β1呈劑量及時間依賴性誘導

13、NRK-49F細胞表型改變和形態(tài)學變化，阻止細胞增殖，減少細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降低細胞的遷移力。HSP72通過抑制細胞活力和DNA合成，減少PCNA，Survivin和Bcl-xl蛋白的表達，阻抑TGF-β1介導的NRK-49F細胞增殖。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，HSP72不能抑制NRK-49F細胞的凋亡，但是HSP72使TGF-β1作用下NRK-49F細胞周期分布發(fā)生顯著變化，細胞主要停滯于G1期，并分別下調(diào)和上調(diào)細胞周期蛋白Cyclin

14、D1和p21的含量。Westem blot和免疫熒光結(jié)果顯示，HSP72高表達可顯著抑制TGF-β1作用下的Stat3活化和核易位。熒光素酶報告基因證明，HSP72能降低Stat3轉(zhuǎn)錄活性。Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)，HSP72與Stat3之間存在相互作用，且HSP72高表達時該作用明顯增強。
　　 (2)體內(nèi)研究。
　　 目的：探討HSP72對腎臟組織Stat3蛋白表達以及活化的影響。
　　 方法：應用GGA特異性誘導

15、HSP72在腎臟高表達，或GGA給藥前2小時腹腔注射槲皮素Quercetin(100mg/kg)。建立大鼠UUO模型，7天后處死大鼠留取腎組織標本，Western blot和間接免疫熒光檢測α-SMA，F(xiàn)ibronectin，CollagenⅠ蛋白表達和Stat3活化情況；Picrosirius Red染色檢測組織中膠原蛋白含量。
　　 結(jié)果：大鼠UUO7天時，腎臟組織α-SMA，F(xiàn)ibronectin，CollagenⅠ和Co

16、llagenⅢ蛋白表達明顯增多，磷酸化Stat3(p-Stat3)水平顯著增加。免疫熒光結(jié)果顯示，p-Stat3主要分布在腎臟實質(zhì)細胞核內(nèi)。GGA誘導腎臟HSP72高表達，可顯著抑制α-SMA，F(xiàn)ibronectin的表達和膠原蛋白的含量，以及p-Stat3水平和細胞核易位；槲皮素抑制GGA誘導的HSP72蛋白表達水平，并消除GGA阻抑Stat3活化和腎臟纖維化的保護作用。
　　 小結(jié)：①HSP72可顯著抑制TGF-β1作用下成

17、纖維細胞的活化增殖和功能。②HSP72降低TGF-β1誘導成纖維細胞的Cyclin D1表達水平，升高p21的表達，抑制DNA合成，使細胞停滯于G1期，從而阻抑細胞增殖。③HSP72通過抑制TGF-β1作用下成纖維細胞Stat3的活化水平、p-Stat3細胞核易位以及降低Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，阻止Stat3介導的細胞增殖和存活。④GGA誘導HSP72高表達可顯著降低大鼠UUO模型腎組織p-Stat3水平和細胞核易位，抑制腎間質(zhì)纖維化的程

18、度。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴HSP72通過抑制腎小管上皮細胞Smad3的磷酸化，p-Smad3細胞核易位，以及上調(diào)Smad7，調(diào)控TGF-β/Smads信號通路介導的EMT。
　　 ⑵HSP72的PBD結(jié)構(gòu)域是HSP72發(fā)揮抗EMT作用的關(guān)鍵功能域。
　　 ⑶HSP72通過抑制成纖維細胞Stat3的活化水平、p-Stat3細胞核易位以及降低Stat3的轉(zhuǎn)錄活性，阻止Stat3介導的細胞增殖、存活和細胞侵襲