大蒜有機硫化合物及其類似物的心血管保護作用.pdf

1、[目的]大蒜已被證實具有心臟保護作用,其活性成分主要為含硫化合物。本研究通過研究大蒜有機硫化合物及其類似物的心臟保護作用,比較不同的半胱氨酸衍生物對心肌細胞損傷的保護作用,篩選優(yōu)勢候選化合物,并探討其對缺血性損傷心肌細胞的抗氧化和抗凋亡作用,進一步闡明其作用途徑和機制,為臨床有效治療缺血性心臟病研發(fā)新藥提供理論基礎(chǔ)。
　　 [方法]1.以原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞為研究對象,細胞缺氧6h復(fù)氧3h制模,分為正常對照組、缺氧復(fù)氧模型組、七

2、個半胱氨酸衍生物干預(yù)組。MTT法檢測細胞存活率,檢測細胞內(nèi)及培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性、細胞上清液H2S濃度,并測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(MDA)和凋亡相關(guān)因子Caspase-3活性,采用RT-PCR方法觀察CuZn-SOD和Mn-S

3、OD、Caspase-3及胱硫醚-γ-裂解酶(cystathione-γ-lyase,CSE)mRNA的表達,Hoechst染色觀察凋亡形態(tài)學(xué)變化。2.結(jié)扎大鼠左冠狀動脈制備急性心肌梗死(myocardial infarctiorL,MI)模型,分為假手術(shù)組、MI模型組以及SPC、SAC和SPRC預(yù)處理組。觀察死亡率及梗死面積,檢測大鼠血漿H2S濃度和心室肌組織CSE活性,觀察血清酶學(xué)變化及心肌組織中抗氧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物(g

4、lutathione pemxidase,Gpx)活性、GSH和GSSG氧化還原狀態(tài)以及MDA含量,采用RT-PCR法觀察SOD各分型及CSEmRNA的表達。3.采用急性心肌梗死大鼠模型,分為假手術(shù)組、MI模型組、炔丙基甘氨酸(Propargylglyeine,PAG)干預(yù)組、SPRC預(yù)處理組及SPRC+PAG干預(yù)組。伊文氏蘭與TTC雙染檢測心肌梗死面積,定位心臟梗死區(qū)和梗死周邊區(qū),并監(jiān)測鼠尾動脈壓和心率觀察心功能改變,通過RT-PCR

5、和weaem blot的方法觀察凋亡相關(guān)因子mRNA和蛋白表達;4.采用急性心肌梗死大鼠模型,隨機分為SPRC組和對照組。分別給予SPRC50mg/kg/d或生理鹽水灌胃,6周后處死動物。經(jīng)右頸總動脈插管檢測心室內(nèi)壓及動脈壓,觀察體重變化及全心濕重、肺重與體重比值,檢測血清中SOD活性及MDA水平,并觀察凋亡相關(guān)因子和心室重構(gòu)相關(guān)的蛋白和mRNA的表達。
　　 [結(jié)果]第1部分:七種半胱氨酸衍生物均能一定程度的提高細胞存活率,減

6、少細胞內(nèi)LDH的漏出,增加GSH水平和CAT活性;SAC顯著提高Mn-SOD和CuZn-SOD活性,并上調(diào)其mRNA表達;SPC、SBC、SPEC和SAMC顯著提高CuZn-SOD的活性;SEC和SPRC則增加Mn-SOD的活性和mRNA表達。SAC、SEC、SPC、SAMC和SPRC降低Caspase-3活性。七種化合物中除了SEC外,細胞上清液中H2S濃度顯著上升,細胞內(nèi)CSEmRNA表達上調(diào)。第2部分:SPC、SAC和SPRC預(yù)處

7、理大鼠死亡率和梗死面積顯著降低,與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),并伴隨血清中H2S濃度升高。另外,三個化合物均可增加SOD和GPx活性、維持心肌細胞內(nèi)GSH水平、并降低MDA濃度。FAG為CSE抑制劑,可阻斷三個化合物對心肌的保護作用。第3部分:SPRC預(yù)處理可改善心功能,維持心肌細胞內(nèi)ATP水平,減小梗死面積。SPRC增加Bcl-2蛋白表達,與模型組相比,分別是模型組梗死周邊區(qū)的1.8倍和梗死區(qū)的3倍;SPRC還可下調(diào)Bax

8、蛋白表達,是模型組梗死周邊區(qū)的0.88倍和梗死區(qū)的0.65倍。SPRC對Bcl-2和Bax mRNA的表達與其對蛋白表達的影響趨勢相同。SPRC還可誘導(dǎo)CSE在心臟梗死及周邊組織的表達,尤其梗死區(qū)更為顯著,與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)意義。SPRC增加血清中H2S濃度,其抗凋亡活性可被PAG阻斷。第4部分:SPRC組與模型組比較全心濕重與體重的比值有減小趨勢,但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。模型組大鼠肺重與體重的比值較假手術(shù)組相比顯著增加,S

9、PRC組大鼠的肺重/體重較模型組明顯降低(P＜0.05),LVEDP升高程度減低,LVSP和+LVdp/dtmax較模型組均有升高,收縮功能改善;SPRC可增加血清中SOD活性,并降低MDA含量;形態(tài)學(xué)顯示SPRC組心肌細胞變形與壞死改變程度較輕,范圍較小,壞死周邊區(qū)炎性細胞浸潤明顯減少;SPRC干預(yù)組大鼠血清H2S濃度增加,在梗死周邊區(qū)和非梗死區(qū)SPRC均呈現(xiàn)增加CSE活性的趨勢。SPRC對大鼠梗死周邊區(qū)和非梗死區(qū)凋亡相關(guān)因子Bax、

10、Caspase-9和Caspase-3有顯著的抑制作用;并下調(diào)心室重構(gòu)相關(guān)的TGF-β1和膠原蛋自ImRNA表達。
　　 [結(jié)論]1.半胱氨酸衍生物對乳鼠心肌細胞缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)損傷具有保護作用,尤其是三碳化合物SPC、SAC和SPRC,2.SPC、SAC和SPRC對急性心肌梗死大鼠有預(yù)防性心臟保護作用,其作用機制與抗氧化和促進內(nèi)源性H2S生成相關(guān),其中尤以SPRC心臟保護作用最為顯著。3.SPRC的心臟保護作用與其調(diào)控線粒體凋亡途