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文檔簡介
1、目的:自噬和凋亡是決定細(xì)胞命運的重要因素,參與各種疾病的病理和生理過程。盡管隨著研究的不斷深入對自噬與凋亡的調(diào)控機制已經(jīng)取得了重要進(jìn)展,但關(guān)于沙眼衣原體引起的自噬和凋亡的具體調(diào)控機制尚未清楚。本研究試圖探討沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白 pORF5對 HeLa細(xì)胞自噬和凋亡的影響,為進(jìn)一步闡明沙眼衣原體的致病機制提供實驗依據(jù)。
方法:將pDSRed C1/pORF5重組菌接種在LB固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~16h,挑取單個
2、菌落,轉(zhuǎn)種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃恒溫振蕩培養(yǎng)4h;按照OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取pDSRed C1/pORF5重組質(zhì)粒;用含NheI、EcoRI酶切位點的pORF5特異性引物擴增pORF5基因,再分別雙酶切 PCR擴增產(chǎn)物和慢病毒表達(dá)載體 DCE(PCDH-CMV-MCS-EF1-COPGFP);酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5α,然后進(jìn)行菌落PCR、雙酶切及測序鑒定;高純度無內(nèi)毒素抽提慢病毒表達(dá)重組質(zhì)粒后,
3、與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后8h更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,上清濃縮后得到高滴度的慢病毒顆粒,采用倍比稀釋法檢測病毒滴度;慢病毒感染HeLa細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察感染情況;流式分選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa;間接免疫熒光方法和Western blot方法鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中pORF5的表達(dá);血清饑餓處理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa細(xì)胞24h
4、,qRT-PCR、Western blot和間接免疫熒光檢測LC3(microtubule-associated protein1 light chain3)、Becin1的表達(dá)水平;TNF-α處理DCE-HeLa和DCE-PORF5-HeLa細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均用血清饑餓和3-MA分別處理,RT-PCR檢測細(xì)胞Bax和Caspase-3的表達(dá)情況。
結(jié)果:
5、 1、成功建立DCE-pORF5-HeLa和DCE-HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,經(jīng)過流式分選穩(wěn)轉(zhuǎn)株純度達(dá)95%以上。
2、間接免疫熒光結(jié)果顯示,饑餓處理的DCE-HeLa和DCE-pORF5-HeLa均出現(xiàn)LC3紅色熒光斑點,定量后分別為(34.0±2.6個/細(xì)胞)和(97.6±12.1個/細(xì)胞),且DCE-pORF5-HeLa較DCE-HeLa點狀熒光斑點明顯增多(P<0.05)。
3、血清饑餓處理的DCE-HeLa細(xì)胞中
6、LC3-II/LC3I比率和Beclin1蛋白表達(dá)水平比未處理組分別增加了56.0%(P<0.01)和57.8%(P<0.01);血清饑餓組處理的DCE-pORF5-HeLa中LC3-II/LC3I比率和Beclin1的蛋白表達(dá)水平比未處理組分別增加了87.2%(P<0.01)和76.6%(P<0.01);饑餓處理的DCE-pORF5-HeLa中LC3-II/LC3I比率和Beclin1的表達(dá)水平比同處理的DCE-HeLa分別升高了53
7、.3%(P<0.01)和28.7%(P<0.05)。
4、饑餓處理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的mRNA表達(dá)水平較同處理的DCE-HeLa分別降低47.6%和25.7%(P<0.05),3-MA處理的DCE-pORF5-HeLa的Caspase-3和Bax的表達(dá)mRNA水平較同處理的DCE-HeLa分別低73.0%和43.6%(P<0.05)。
5、未處理的DCE-HeLa和DCE-pO
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